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红掌帚梗柱孢叶枯病菌的鉴定

2017-07-15刘培培张冰程晓琴王会会

江苏农业科学 2017年9期
关键词:叶枯病红掌

刘培培++张冰++程晓琴++王会会++马瑞++谢昌平

摘要:红掌真菌性叶枯病是近几年在海南新发现的一种病害,在红掌病害中较严重。田间症状是多从叶缘发病,发病初期叶片出现水渍状褪绿病斑,病斑周围有黄晕,后期叶片大面积枯萎,甚至致植株枯死。从中国热带农业科学院周边采集红掌叶枯病病叶,对该病菌进行分离培养。通过对该病原菌的形态鉴定以及rDNA-ITS序列分析,确定引起该病害的病原菌为苞叶芋帚梗柱孢菌(Cylindrocladium spathiphylli Schouties,El-Gholl & Alfieri)。此病原菌引起红掌叶枯病在国内为首次报道。

关键词:红掌;叶枯病;病原菌鉴定;苞叶芋帚梗柱孢菌

中图分类号: S436.8文献标志码: A

文章编号:1002-1302(2017)09-0095-02

红掌(Anthurium andraeanum)别称灯台花、花烛、安祖花,为天南星科(Araceae)花烛属(Anthurium)多年生常绿草本花卉,原产于南美洲的热带雨林地区,现欧洲、亚洲、非洲皆有栽培。由于红掌花色艳丽,花期长,近年来逐步走进家居,成为美化家庭的盆栽,备受国内外消费者喜爱。目前,我国已报道的红掌病害主要有根腐病(Pythium splendens)[1]、炭疽病(Colletorichum destructivum/Colletorichum gloeosporioides)、细菌性叶斑病(Xanthomonas axonopodis pv.citri)、细菌性叶枯病(Pseudomonas/Xanthomonas)[2]、灰霉病(Botrytis cinerea)、褐斑病(Acremonium zonatum)、叶霉病(Cladosporium cladosporioides)、茎基腐病(Phytophthora parasitica、Pythium pringshcim)、苗枯病(Metathizium anisopliae)、根茎溃疡病(Cylindrocladium sp.)、藻斑病(Cephaleuros virescens)。国外已报道的红掌病害有露湿漆斑菌(Myrothecium roridum)引起的叶斑病[3]、由花叶万年青头孢菌(Cephalosporium dieffenbachiae)引起的叶斑病、根腐病(Calonectria crotalariae)、叶疫病(Phytophthora nicotianae)。但由苞叶芋帚梗柱孢菌(Cylindrocladium spathiphylli)引起的红掌叶枯病尚未见报道。

海南省儋州市红掌叶枯病在红掌病害中较严重,多从叶缘发病,引起叶片大面积枯萎,弱化植株生长,甚至致其枯死,造成重大的经济损失。本试验主要是从形态观察和分子鉴定两方面进行研究,确定引起红掌叶枯病病原真菌是苞叶芋帚梗柱孢菌(C. spathiphylli Schoulties,El-Gholl&Alfieri),从而为这种病害的防治提供理论依据。

1材料与方法

1.1病叶采集及症状描述

红掌叶枯病病叶采于中国热带农业科学院周边。按常规方法对田间病株症状进行描述及拍摄。

1.2菌株分离

采用常规组织分离法分离,无菌操作接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上,置于室温下培养。

1.3菌株的致病性测定

采用针刺法进行人工接种。具体方法:先用灭菌针将叶片刺伤,再将分离纯化菌株的菌饼(直径0.45 cm),贴在伤口上,处理10株。同时设与菌饼同样大小的琼脂块作为对照,最后表面覆盖已灭菌的吸水纸,用保鲜袋套住保湿培养4~7 d,观察并记录发病情况。

1.4病原菌菌落和形态观察

将菌种分别接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)和水琼脂培养基(WA)上,室温下培养5 d后,观察菌落的培养性状,包括菌落的颜色、气生菌丝是否发达、分子孢子、不孕附属丝形态和大小,以及是否存在厚垣孢子等。采用培养基表面划伤法来诱导病原菌分子孢子、不孕附属丝和泡囊的产生,具体做法:用灭菌的刀片在培养基表面划上几刀,再置于常温下培养5~10 d,分生孢子、不孕附属丝和泡囊产生,然后再观察分生孢子和不孕附属丝的形态以及测量分生孢子、分生孢子梗和泡囊的大小。

1.5病原菌rDNA-ITS序列分析

用CTAB法提取菌丝的DNA。采用通用引物ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′,ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′扩增菌株的rDNA-ITS片段,并委托天根生化科技(广州)有限公司进行序列测定。对测得的供试菌株 rDNA-ITS 区段的序列,分别运用GenBank核酸数据库中的BLAST工具软件,在DNA序列数据库中搜索同源DNA序列并进行比较分析,根据BLAST搜索和比较的结果,进行同源性分析。

2结果与分析

2.1田间症状描述

该病原菌主要危害紅掌叶片,从叶片边缘开始发病。典型症状:发病初期叶片出现水渍状褪绿病斑,然后逐渐扩大为圆形、卵圆形和不规则的浅褐色至深褐色病斑,边缘有黄色的晕圈,发病后期多个病斑也会联合成片,造成叶片枯死(图1-a)。

2.2菌株的致病性测定

将分离纯化后的菌种接种到健康的叶片上,经过4~7 d后的观察,针刺法接种的叶片全部发病,且症状与初始分离所选叶片相同(图1-b,图1-c),对照叶片没有发病症状(图1-d)。以接种后发病叶片作为分离材料再次分离,所得菌与初次分离所得菌落的分生孢子形态等相同,符合柯赫氏法则。

2.3病原菌菌落和形态观察

在PDA上培养,病原菌的菌落圆形,红棕色,边缘整齐且颜色较浅,气生菌丝发达(图2-a)。而通过在培养基表面划伤后,菌落的刮伤处会散生许多白色粉状物,即为病原菌的不孕附属丝、分生孢子梗和大型分生孢子。泡囊为无色,棍棒状,大小为4.2~5.9 μm(图2-c);分生孢子梗扫帚状,一级分枝长度为14.3~22.7 μm,二级分枝长度为10.1~14.7 μm,三级分枝长为8.6~12.3 μm(图2-c);大型分生孢子无色,圆柱状,两端圆形,多数无分隔,少数1~2个分隔,其长为35.3~46.5 μm,宽为3.5~4.7 μm(图2-b);还可见厚垣孢子,未见有小型分生孢子产生。在WA上培养时,产生的大型分生孢子与PDA上培养产生的大型孢子基本一致(图2-e),分生孢子梗末端膨大(图2-d),未见有小型分生孢子产生[4]。通过对培养性状和形态学的观察,进行查阅相关资料,初步鉴定引起该病害的病原菌所在属为帚梗柱孢属(Cylindrocladium)。

2.4病原菌rDNA-ITS测序分析与同源性比较

以提取病原菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增,3个样品均可扩增出1条大小与预计长度符合约600 bp的特异片段。以转化后收集的菌液进行PCR扩增,克隆的结果与基因片段PCR扩增结果一致,长度约为600 bp。片段经克隆、测序后放到NCBI进行BLAST比对(GenBank:EU285-555.1),结果表明,该病原菌目的片段的序列与数据库中已有的苞叶芋帚梗柱孢菌(C.spathiphylli Schouties,El-Gholl & Alfieri)ITS核苷酸序列(GQ280627.1)有极大的相似性,同源性高达99%。

3结论与讨论

目前,国内尚未对由苞叶芋帚梗柱孢菌引起的红掌叶枯病报道,黄志朋对红掌茎基腐病病原进行研究,提出帚梗柱孢霉(Cylindrocladium sp.)可侵染红掌根茎部或茎基部引起根茎溃疡病[5],但未提到该病原可危害红掌叶片,也未确定病原具体种。毕可可等对白掌病害进行研究,确定苞叶芋帚梗柱孢菌是白掌褐腐病的致病菌[6-7],但在红掌上还未见报道。

本研究针对红掌叶枯病进行了病原菌分离,通过对分离菌株的形态特征和rDNA-ITS序列同源性的分析,将分离的菌株鉴定為苞叶芋帚梗柱孢菌(C. spathiphylli Schouties,El-Gholl & Alfieri),本结论为国内首次报道。该研究为有效防治红掌叶枯病提供了理论依据,使用何种药剂及如何有效防治有待进一步研究。此外,由于真菌引起的红掌叶枯病和细菌引起的红掌叶枯病在病株上产生的症状十分相似,所以在鉴别红掌叶枯病病原时,可首先通过切取叶片病斑组织做显微镜检查,如果发现有细菌溢留现象,则为细菌性叶枯病。

参考文献:

[1]周晓云,游春平. 红掌根腐病病原鉴定及其PCR检测方法[J]. 园艺学报,2013,40(5):989-996.

[2]梁丽雯,任希望,高志亮,等. 红掌细菌性叶枯病病原菌的分离与鉴定[J]. 热带生物学报,2013,4(4):327-331.

[3]Ben H Y,Zhao Y J,Chai A L,et al. First report of Myrothecium roridum causing leaf spot on Anthurium andraeanum in China[J]. Journal of Phytopathology,2015,163(2):144-147.

[4]Crous P W,Wingfield M J. A monograph of Cylindrocladium,including anamorphs of Calonectria[J]. Mycotaxon,1994,51(27):393-404.

[5]黄志朋. 红掌茎基腐病病原菌鉴定及防治药剂的筛选[D]. 广州:仲恺农业工程学院,2013.

[6]毕可可,周佳暖,习平根,等. 匙叶天南星根茎腐烂病病原鉴定[C]//中国菌物学会. 中国菌物学会2009学术年会论文摘要集,2009.

[7]马凯生. 广州白掌主要土传真菌病害鉴定及防治药剂的筛选[D]. 广州:仲恺农业工程学院,2015.

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