张桂鑫，刘 杰，赵 宇，王世浩，刘树华，付 赛，龚春柱，王常德，万 雷，张 乐

(1. 广州中医药大学，广东 广州 510405；2. 广州中医药大学附属深圳平乐骨伤科医院，广东 深圳 518010；3. 广州中医药大学第三附属医院，广东 广州 510405；4. 山西中医药大学，山西 太原 030024)

骨质疏松症(OP)是与年龄相关，以骨量下降、骨的微细结构破坏导致骨脆性增加，易发生骨折为特征的全身性代谢性骨病[1]。OP作为老年人群的常见病及多发病，伴随着我国人口老龄化程度的进一步加深，其发病率逐年攀升，严重影响中老年人群的生活质量，增加了民众的医疗支出，加重了国家的财政负担。目前OP的临床治疗效果仍不尽如人意，研究者多关注于成骨细胞和破骨细胞的平衡机制[2]。近年来，随着对骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化研究的深入，许多学者逐渐认识到BMSCs成脂向分化在OP发生发展中发挥着重要作用，BMSCs的成骨/成脂向分化形成了一种类似“拮抗”的关系[3]。相关研究显示细胞外信号调节激酶5(ERK5)信号通路活化在促进骨形成中发挥着重要作用[4-9]，当ERK5信号通路受到抑制时,骨组织内出现大量的脂肪细胞，骨小梁变得稀疏、甚至断裂，高度重现了骨质疏松患者的骨组织临床形态学变化，这与骨质疏松的“Fat-theory”理论符合[10]。而在OP发病、发展中ERK5信号通路介导下BMSCs各态分化改变特点与中医阴阳理论中的对立制约、互根互用、交感互藏等内涵高度相似。因此，本课题组尝试运用中医阴阳自和理论来指导并探讨ERK信号通路介导下BMSCs成骨/成脂向分化与OP之间的内在联系和规律，为OP的认识和防治提供新的思路与方向。

1 阴阳自和的渊源及内涵

“阴阳自和”首述于张仲景《伤寒论》第58条，但未进行深入阐述[11-12]。后世医家不断对仲景“阴阳自和”精义进行了探讨与发挥，由此形成了迥然不同的观点。《医宗金鉴》言：“凡病……施治得宜,自然愈矣。即或治未得宜，虽不见愈,亦不致变诸坏逆……可不必施治,惟当静以俟之,诊其阴阳和,必能自愈也。”认为阴阳调和而疾病自愈，当以静处之，不妄施治，待其复趋平衡而邪去正安。柯琴则认为必须通过外在力量的引导而使阴阳调和，指出“欲其阴阳自和,必先调其阴阳之所自……益血生津,阴阳自和矣。”[13]程钟龄宗《内经》“谨察阴阳所在而调之，以平为期”，明确将“和阴阳”列入中医八法，其中“和法”即是指运用调和脏腑、调治气血、和解表里等方法，使机体阴阳重归平和而病邪自除。

早在《素问》便有“阴阳者，天地之要也，万物之纲纪……生杀之本始”的记载，其用“阴平阳秘，精神乃治”简简八字便指出了阴阳双方的消长平衡是维持人体正常生命、精神活动的内在基础。“凡阴阳之要……两者不和，若春无秋，若冬无夏。因而和之，是谓圣度。”进一步阐释了阴阳自和是机体固有的调节自身阴阳消长、平衡从而不断自我修复、自我完善的能力及过程；同时还指出治病当以调和阴阳为纲，“因而和之”，运用调和气血等法对机体阴阳消长进行引导趋化，从而达到阴阳平和、气血平治的目的。总的而言，阴阳自和的内涵主要包含三个方面：其一，阴阳失衡是人体一切疾病最基本的病机，调和阴阳是治疗一切疾病的总则。其二，阴阳自和是人体自体的调控机制和自我调节使阴阳重新趋于平衡的能力，是基于阴阳双方对立制约、互根互用、消长转化等交互作用自发形成的，是阴阳相互关系的根本属性之一[14]。其三，临证治疗时应善于辨识和利用人体阴阳自和的能力与趋势，强调因势利导，选择恰当的治疗方法，调和阴阳，使机体恢复阴阳平和的状态。

2 从肾阴阳自和论治OP

2.1OP本之于肾 中医认为，OP归属于“骨痿”“骨痹”“骨枯”的范畴。根据OP的发病特点及临床表现，历代医家总结其发病发生与肾的阴阳失衡直接相关，提挈出了OP发病中肾精亏虚、骨枯髓减为本，瘀血痹阻、骨络失荣为标的病机关键。明·张景岳明确提出了“肾痿者，骨痿也”的论点，这一论断早在《黄帝内经》便已有体现。《素问·痿论》已有“肾主身之骨髓……骨枯而髓减……发为骨痿”的记载，指出OP的发生与肾中精气不足的直接相关性。《医经精义》对“肾主骨”理论进一步注解：“肾藏精，精生髓，髓生骨，故骨者肾之所合也。健者肾精所生，精足则髓充，髓充者则骨强。”阐明了肾-精-髓-骨生理调节轴的调控机制。《逆调论篇》则开“骨痿自肾阴阳论治”之先河，认为“肾不生，则髓不能满；肾气热，则腰脊不举……水不胜火，骨枯而髓虚，足不任身，发为骨痿”，明确肾之水火安济(阴阳平和)与骨痿发生的直接关系，与“肾主骨”理论同为后世医家们临证论治奠定了坚实的理论基础。近年来，对OP的中医临证分型研究进一步深入。万雷等[15]一项临床调查(广东省373名OP患者)显示OP患者以脾肾阳虚及肝肾阴虚型最为常见(脾肾阳虚130例占34.85%，肝肾阴虚161例占43.16%)。中国老年学和老年医学学会综合了多中心研究发布了中医药防治原发性骨质疏松症专家共识[16]，将原发性骨质疏松症分为肾阳虚、肝肾阴虚、脾胃虚弱、脾肾阳虚、肾虚血瘀和血瘀气滞六个主证。这些研究均强调了肾阴阳失衡在OP发病和临床辨证论治中的重要地位。

2.2阴阳自和与BMSCs成骨/成脂分化 OP的分子生物学发病机制尚未完全阐明，目前较为统一的认识是成骨/破骨细胞介导的骨形成/骨吸收的平衡遭到破坏，而“RANKL-RANK-OPG”传递调节轴是其调节基本机制[17]。这一理论和调控方式本质上与中医阴阳学说和脏腑协同理论的内涵是相一致的，然而OP发病机制复杂，在这一理论指导下运用单纯的靶点治疗技术对成骨或破骨细胞活性进行调节干预并不能满足患者的健康医疗需求。近期研究发现OP患者BMSCs 的成脂分化能力明显强于成骨分化能力, 这可能是由于患者的BMSCs成脂分化和成骨分化的平衡被打破所致[10]。然而BMSCs的成骨分化和成脂分化过程复杂，多种成脂和成骨形成因子参与调节[18-19]，其中2型过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ2)可明显促进成脂分化[20]。而Runt相关转录因子2(RUNX-2)作为成骨相关基因表达中核酸和相关调节因子的“支架蛋白”，是间充质干细胞的成骨向分化和骨形成所必需的存在，其高表达表明BMSCs将向成骨方向分化[21]。

《阴阳应象大论》言“阳化气，阴成形”、“阴静阳躁，阳生阴长，阳杀阴藏”。中医阴阳学说根据阴阳的生理功能和特性，认为具有推动、温煦、兴奋作用的物质和功能归属于阳，具有凝聚、凉润、抑制等作用的物质则归属于阴。在既往关于骨重建基本单元阴阳属性的认识中，将负责骨基质合成、分泌矿化的成骨归属于阴，而负责骨吸收、降解的破骨细胞划归于阴[22-23]。马勇等基于《内经》阴阳变易思想，进一步提出了骨病治疗当以“阴阳为纲,气血为本,阳气为先”的原则[24-25]。他们认为人的正常生命活动既依赖于骨组织及精血、津液等“阴凝之形”，亦需要骨髓脂肪组织等属“阳”之物的调节和气化。而研究发现，骨髓微环境的细胞增殖变化受激素、生长调节因子、药物等影响，骨髓中骨含量与脂肪组织含量之间呈现出明显负相关关系。随着对这一表型研究的深入，发现BMSCs的成骨/成脂分化之间存在的对立消长、动态平衡的特点同样切合中医“阴阳自和”理论的深刻内涵。“万物负阴而抱阳，冲气以为和”、“阴阳和合而万物生”，阴阳的对立消长平衡是人体，乃至天地万事万物的内在运动规律。在BMSCs的分化代谢中这种内在规律则体现为成骨和成脂之间的制约平衡，使得机体骨代谢得以长期处于不断自我修复、更新、完善、调和的稳态，从而达到“阴阳均平，以充其形”的生理和谐[26]。

3 ERK5与BMSCs成骨/成脂分化

ERK5是目前研究较少的通路，其激活与细胞的增殖、分化和迁移密切相关。ERK5信号通路的激活包括3级级联放大反应，依次通过MAPKKKs激活MEKK2和MEKK3，然后磷酸化MEK5(Ser311/Thr315)，激活的MEK5双磷酸化ERK5(Thr218/Tyr220)。磷酸化的ERK5可以通过改变蛋白构象由折叠构象变为横行构象，从而破坏核输出信号(NES)，促进ERK5的核聚集(或者称为核转位现象)，进入胞核的ERK5可以作用其下游分子，产生众多生理学效应[27-28]。

3.1ERK5与成骨 早在2012年Li等[8]在应用流体剪应力(FSS)诱导MC3T3E1前成骨细胞ERK5磷酸化时，FSS会以强度和时间依赖的方式引起ERK5的激活，同时诱导磷酸化的ERK5转位至细胞核。他们进一步的研究则揭示了ERK5介导FSS诱导的AP-1和cyclinD1表达，抑制p-16信号转导，促进细胞增殖，表明了ERK5在成骨细胞增殖过程中扮演者重要的角色[9]。Bin等[7]在其研究基础上进一步发现了FSS能够通过ERK5信号通路阻断TNF-α诱导的MC3T3E1细胞凋亡。ERK5通过抑制成骨细胞中TNF-α介导的信号事件，包括增加Bad磷酸化，抑制caspase-3活性，而Bad是ERK5的关键下游靶点，进一步表明ERK5信号通路在FSS介导的成骨细胞抗凋亡中起着重要作用。Bin等[5]发现 FSS通过激活ERK5-AKT-FOXO3a信号通路，降低FasL和Bim的表达，抑制caspase-3的激活，从而起到保护成骨细胞凋亡的作用。杨信信[29]研究发现，对ERK5基因沉默后证实ERK5信号通路能够下调RUNX-2、碱性磷酸酶(ALP)、骨形态发生蛋白-2(BMP-2)表达而抑制BMSCs成骨分化。

3.2ERK5与成脂 Tontonoz等[30]研究发现PPARγ的激活可通过下调RUNX-2 表达和干扰RUNX-2的反式激活能力来抑制骨钙蛋白的表达，提示BMSCs成骨分化和成脂分化间可能存在此消彼长的平衡关系。杨信信[29]发现ERK5信号通路可通过上调PPARγ、CCAAT-增强子结合蛋白α(C/EBPα)和脂肪酸结合蛋白4(ap2)表达而抑制小鼠BMSCs的成脂分化；当成脂分化诱导足够时长后，观察到了脂滴的明显增多、增大和增圆及染色的显著加深。上述研究提示 ERK5 信号通路可通过调控BMSCs成脂和成骨分化的关键基因，维持BMSCs成脂和成骨分化的平衡，进而影响OP的发生发展。

3.3ERK5与阴阳自和 从微观角度而言，人体的细胞、组织、DNA 等无不蕴含着阴阳对立统一关系[31]。OP患者BMSCs中所存在的成骨/成脂向动态分化平衡、ERK5介导下BMSCs的成骨/成脂双向动态调控机制同样包含着中医“阴阳自和”理论的深刻内涵。“阳胜则阴病”，当ERK5被沉默，PPARγ、C/EBPα和ap2等成脂分化标志基因的高度表达导致BMSCs成脂向分化的活跃，同时通过抑制RUNX-2、ALP和BMP-2的表达导致成骨作用减弱，并通过多通路激活caspase-3活性导致成骨细胞的凋亡，最终导致骨质疏松的发生。反之，“阴胜则阳病”，当ERK5信号激活，BMSCs成脂向分化受到抑制，RUNX-2、ALP和BMP-2高度表达，而成骨向分化显著增强，同时成骨细胞增殖活跃，凋亡减少，改善OP患者的骨代谢失衡，使机体精充髓足，筋骨隆盛。

4 小 结

从最初发现成骨/破骨细胞介导的骨形成与骨吸收有机统一，到“RANKL-RANK-OPG”传递轴的阐明，再到BMSCs成骨/成脂分化调节，OP的微观分子调控与中医阴阳调和及多脏腑协同理论不谋而合。而BMSCs的成骨/成脂动态平衡，为我们提供了OP防治不同于以往的思路。基于肾阴阳自和理论，对ERK5介导调节BMSCs的成骨/成脂分化稳态平衡深入研究，更为我们进一步阐明OP发生发展的复杂机制提供了新的启发和方向。

OP 的病机复杂多样，虚中夹实，实中含虚，机体阴阳动态制约平衡。在这一过程，中医及中药复方显示出其多靶点、多途径和多角度的整体治疗特点，展现了令人可喜的疗效。多项临床研究表明左归丸等补肾中药与复方能够有效缓解OP患者的疼痛症状，并改善相关血清学指标，对OP患者的骨代谢平衡及骨密度的改善具有良好的疗效[32]。而目前骨疏康颗粒、金天格胶囊等中药复方合剂亦逐渐成为中西医结合防治OP的主要用药选择。

针对OP肾精亏虚、骨枯髓减为本，瘀血痹阻、骨络失荣为标的病因病机，着眼于OP患者病后“多虚多瘀”的转归发展特点，我们课题组创立了补肾健脾活血方应用于OP患者的治疗。内经言：“年六十，阴痿，气大衰，九窍不利，下虚上实。”补肾健脾活血方强调肾为先天之本，以淫羊藿、肉苁蓉、熟地等益精填髓之品调补肾之阴阳，使阴阳均而气血平；同时重视“脾为后天之本，气血生化之源”，运用黄芪、白芍补气运脾诸药以顾护中焦，以中焦运气生血，使先天之阳得生而后天之阳得立。“气为血之帅，血为气之母”，针对OP常多夹瘀的转归特点，取补血活血行血之当归、丹参等，达到阴阳并调，气血同治的目的。早期的动物试验和临床干预研究已明确补肾健脾活血方对OP具有多靶点调控作用[33-35]，然而目前对于其对成脂肪分化干预及作用机制我们尚未能深入研究。当代医学生物信息学高速发展，基因工程、表观遗传学、DNA甲基化飞速发展，BMSCs成骨/成脂动态分化平衡为我们提供了新的启发，而ERK5信号通路在其中的重要作用及补肾健脾活血方对此的新作用靶点值得我们进一步深入挖掘。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。