陈正永，杨婧，曾晓玲

(1.贵州医科大学，贵阳 550004； 2.贵州医科大学附属医院产科，贵阳 550004； 3.贵州省人民医院产科，贵阳 550002)

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一种具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，在特定条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞等，有助于组织分化和再生等功能[1]。在体内，MSCs的分化作用与细胞外信号转导、特定的信号通路等有关。转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)家族成员可通过控制关键转录因子的表达和活性调节MSCs分化为特定细胞的进程[2]。而TGF-β家族成员配体则可在细胞表面与特定的四聚体跨膜受体复合物(由两种Ⅱ型受体和两种Ⅰ型受体组成)结合，与受体复合物结合的配体可通过诱导Ⅱ型受体对Ⅰ型受体中的Ⅰ激酶结构域磷酸化导致细胞内信号转导介质激活[3]。TGF-β家族配体包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、激活素以及生长分化因子等。TGF-β与相应的受体结合后导致该受体发生磷酸化，从而激活特定的Smad蛋白，这些蛋白易位至细胞核中形成激活或抑制性转录调控复合物，从而控制靶基因转录[4-5]。现就TGF-β在MSCs分化中的作用研究进展予以综述。

1 TGF-β概述

TGF-β在人体内的所有细胞中均表达，对正常发育和体内平衡起重要作用。TGF-β超家族包括TGF-β、激活素、抑制素、生长分化因子和BMP等30多种结构相关的蛋白质；TGF-β家族成员在许多细胞过程中均具有重要作用，包括免疫抑制、生长抑制、上皮-间充质转化、细胞迁移、侵袭以及细胞外基质重塑等[4]。TGF-β有3个受体，即TGF-β受体(TGF-β receptor，TGFBR)1、TGFBR2和TGFBR3，当3种配体之一与TGFBR2结合时，即会发生典型的TGF-β信号转导。TGFBR2可募集并磷酸化TGFBR1，而磷酸化的TGFBR1又可磷酸化下游Smad2和Smad3 C端的丝氨酸残基(pSmad2/3C)，然后募集Smad4并转移至细胞核，在核中Smad4调节TGF-β靶基因转录；另一方面，Smad7被募集至激活的TGFBR或pSmad2/3C复合物中，并通过Smad特异性E3连接酶启动降解功能[3]。TGF-β还可与其受体结合通过刺激多种激酶[如促分裂原活化的蛋白激酶、胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)等]激活非经典TGF-β信号转导；此外，Smad依赖性和Smad非依赖性信号均可通过与其他信号通路的互相作用调控细胞分化类型的特异性[4]。

2 TGF-β在MSCs分化中的作用

2.1TGF-β在成骨分化中的作用 成骨细胞发育主要分为增殖、基质成熟和矿化3个阶段，这种分化过程取决于Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2，RUNX2)和Osterix，成骨细胞可分化为骨细胞，被包裹在矿化骨中，具有调节代谢、骨重塑等功能[6]。MSCs向成骨细胞的转化主要由RUNX2诱导，RUNX2是成骨细胞分化的主要转录因子，在成骨细胞分化的早期阶段可促进MSCs分化为前成骨细胞，同时抑制MSCs向脂肪细胞系转化；而成骨细胞的分化和成熟则由转录因子Osterix驱动，从而增强碱性磷酸酶活性、增加矿化，但RUNX2对于MSCs分化为成熟的成骨细胞并不重要，在分化后期其表达水平降低[7-8]。

TGF-β家族成员可调节早期骨髓基质向成熟基质分化过程中成骨细胞和骨细胞的分泌。TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3对成骨细胞的影响均具有时间和剂量依赖性，且在其分化的不同阶段具有不同的作用。实验表明，TGF-β可促进骨祖细胞增殖、早期分化和基质产生，同时抑制后期分化和基质矿化[9]。TGF-β配体可通过经典的Smad2和Smad3信号转导通路以及非经典信号通路调节成骨细胞分化。成骨细胞中的Smad2过表达，可抑制RUNX2的表达但不影响其转录活性；Smad3表达增加可在分化早期降低RUNX2的表达及转录活性，在后期却可增加其表达；激活Smad3可在早期促进成骨细胞的分化进程，并增加碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原蛋白以及参与基质矿化蛋白的表达[10]。Smad2可通过ERK通路的非经典TGF-β信号转导抑制碱性磷酸酶表达、促进胶原蛋白合成，而Smad3可通过ERK1/2和p38信号通路抑制骨钙素表达；作为一种反馈机制，TGF-β可通过ERK和c-Jun氨基端激酶通路抑制Smad3的转录[11-12]。此外，TGF-β还可通过ERK通路阻止终末分化细胞的凋亡，从而控制成骨细胞向骨细胞的分化进程[13]。TGF-β信号与其他信号通路相互作用也可影响成骨细胞分化，特别是BMP对TGF-β通路具有至关重要的作用。BMP-2可通过抑制TGFBR2的表达、促进细胞内重定位，抑制TGF-β信号转导；此外，TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3均可通过激活编码硬化蛋白的SOST(sclerostin)基因抑制骨中的Wnt信号转导；TGF-β还可通过激活Smad3和PI3K信号通路调控β联蛋白的表达，当β联蛋白表达降低时，TGF-β则不再抑制骨髓MSCs(bone marrow MSCs，BMSCs)分化，表明TGF-β和Wnt信号协同可抑制成骨细胞分化[14]。

此外，TGF-β还可调节多种生长因子的表达。在BMSCs中，TGF-β可通过上调BMSCs中的成纤维细胞生长因子2、胰岛素样生长因子1和结缔组织生长因子的基因转录水平，促进胶原蛋白基质的产生[14]。肿瘤坏死因子-α可通过核因子κB阻止TGF-β激活Smad2和Smad3，与其抑制Smad1、Smad5和Smad8激活的作用类似，表明肿瘤坏死因子-α具有促进成骨细胞分化的功能[10]。

2.2TGF-β在软骨分化中的作用 MSCs分化为软骨细胞需要软骨细胞转录因子性别决定区Y框蛋白(sex-determining region Y-box，SOX)9的参与，而SOX9蛋白是高迁移率蛋白转录因子家族成员；Nkx3.2(NK3 homeobox 2)可通过阻断SOX9转录抑制剂的表达维持SOX9的表达，且两者可以相互诱导表达；在分化后期，SOX5、SOX6与SOX9共同促进软骨细胞分化，但晚期肥大软骨细胞中的SOX9表达水平降低[15]。

TGF-β在细胞培养和体内研究中均显示出软骨诱导能力。研究显示，TGF-β可诱导胚胎大鼠肌肉MSCs向软骨细胞分化[16]。TGF-β配体和受体在骨骼系统中广泛表达，并在间充质凝聚过程中起关键作用。TGF-β不会促进在塑料或Ⅰ型胶原上培养的BMSCs向软骨细胞分化，但可促进在基质胶中培养的BMSCs向软骨细胞分化[17]。在基质胶中培养BMSCs时，TGF-β可诱导BMSCs中的Wnt7a表达，导致神经钙黏素表达，从而增加软骨分化所需的细胞与细胞间的接触；在骨膜下注射TGF-β可导致软骨细胞增殖、分化以及软骨形成增加[16-17]。在软骨内骨形成过程中，软骨膜是TGF-β1信号转导的关键部位，TGF-β1可通过调控胶原蛋白X的表达导致跖骨培养物中软骨细胞增殖和软骨形成分化部分减少；在培养前去除软骨膜，则可降低TGF-β1的抑制作用[3]。软骨膜可产生并分泌控制软骨细胞分化的生长因子，如印度刺猬因子、音猬因子以及甲状旁腺素相关肽等。印度刺猬因子和音猬因子可诱导软骨膜TGF-β2表达，从而诱导甲状旁腺素相关肽表达并抑制肥大软骨细胞的产生，但TGF-β1对纵向骨生长的抑制作用与甲状旁腺素相关肽无关[17]。在软骨分化和生长板发育过程中，TGF-β与BMP信号通路存在相互调节作用。在软骨细胞中，BMP-2可抑制TGF-β诱导的Smad激活和BMP-Smad信号转导，在成肌细胞、小鼠胚胎成纤维细胞和肝癌细胞中BMP-2也具有类似的调控作用[18]。研究发现，在小鼠成软骨细胞中TGF-β与BMP信号存在相互作用，可通过形成类似于印度刺猬因子和甲状旁腺素相关肽的反馈回路精确调节生长板的长度[19]。

2.3TGF-β在成肌细胞分化中的作用 MSCs肌源性分化的关键转录因子包括生肌调节因子(myogenic regulatory factor，MRF)5、MRF4、成肌分化抗原以及肌细胞生成素等，这些转录因子可与肌细胞增强因子协同作用。其中，生肌因子5(myogenic factor 5，MYF5)、MRF4和成肌分化抗原对MSCs肌源性分化作用至关重要，而肌细胞生成素与MRF4、成肌分化抗原和肌细胞增强因子2家族成员共同诱导晚期肌肉特异性基因的表达，驱动肌源性分化的进展[4]。TGF-β家族的多个成员均参与协调细胞分化过程，其对成肌细胞分化的调节作用取决于细胞类型、分化状态以及细胞因子和TGF-β家族配体。

在体外试验中，TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3可抑制成肌细胞增殖、分化和肌管形成，但在胚胎研究中，TGF-β可促进胚胎成肌细胞分化，研究结果不一致的原因可能与胚胎和胎儿成肌细胞表面分子、转录因子存在差异表达以及对TGF-β及其配体的敏感性不同有关[20]。使用干扰小RNA沉默Smad2和Smad3可增加大鼠成肌细胞中肌细胞生成素的表达，同时促进后期分化标志物肌球蛋白和肌管融合的表达，表明TGF-β信号转导可部分抑制早期成肌细胞分化，且是正常晚期成肌细胞分化所必需，其可通过Smad依赖性机制发挥作用[21]。但TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3对体内成肌细胞具有不同的影响。TGF-β1水平在肌管发育过程中保持恒定，TGF-β1-/-小鼠显示正常的肌管形成和肌纤维发育；TGF-β2在发育和再生肌肉中由肌管表达，其表达水平随着发育过程而增加，表明TGF-β2在晚期成肌细胞分化和体内肌管形成过程中发挥作用[22]。研究发现，在小鼠成肌细胞C2C12细胞中过表达失活形式的TGFBR2，然后将过表达的细胞注入小鼠体内，结果未显示分化作用；肌肉组织受伤后，TGF-β1和TGF-β3从受损的肌肉组织和血小板中释放出来，并刺激肌肉内的生肌细胞合成TGF-β；TGF-β对炎症细胞(如中性粒细胞和巨噬细胞)具有趋化作用，而炎症细胞又可分泌促炎因子(包括成纤维细胞生长因子、肿瘤坏死因子和白细胞介素-1)，从而诱导血管生成并促进伤口愈合；此外，TGF-β1还可在损伤修复过程中诱导肌肉缺损周围细胞外基质蛋白的表达，并促进肌纤维基膜再生[23]。

2.4TGF-β在脂肪细胞分化中的作用 根据功能不同，脂肪组织可分为白色脂肪组织和棕色脂肪组织，白色脂肪组织主要用于储存能量，棕色脂肪组织主要用于产热。白色脂肪组织和棕色脂肪组织位于身体解剖学上不同的位置，其中，白色脂肪组织位于腹内，也称为内脏脂肪和皮下脂肪，而棕色脂肪组织最常位于颈部和锁骨上区域。冷暴露或β-肾上腺素能刺激均可诱导白色脂肪组织中出现棕色脂肪样组织，这种现象称为白色脂肪组织褐变。白色脂肪组织中的棕色脂肪样组织与棕色脂肪组织表达相同水平的解偶联蛋白1，而解偶联蛋白1对于产热至关重要；虽然棕色脂肪组织中的棕色脂肪细胞属于MYF5+谱系，但白色脂肪组织中的棕色脂肪细胞与白色脂肪组织中的其他细胞则均属于MYF5-谱系，这些细胞构成了第3种类型的脂肪细胞，即“米色”脂肪细胞或“白褐色”脂肪细胞[24]。未分化的MSCs最初可分化为前脂肪细胞并通过有丝分裂进行增殖，CCAAT/增强子结合蛋白中的β和亚基是刺激前脂肪细胞进一步分化的关键，可通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ2和CCAAT/增强子结合蛋白α的表达，导致终末分化阶段的细胞出现生长停滞[25]。此外，TGF-β在脂肪生成过程中具有抑制作用。TGF-β处理可增加小鼠前脂肪细胞3T3-F442A增殖，并有效抑制小鼠胚胎成纤维细胞向脂肪细胞分化[26]。TGF-β1转基因小鼠的白色脂肪组织和棕色脂肪组织细胞数量均显著降低，表明TGF-β可抑制脂肪生成[27]。在脂肪生成过程中，Smad2、Smad3和Smad4的表达水平在前脂肪细胞3T3-F442A中保持不变，而Smad6和Smad7的表达水平则显著降低；Smad2或Smad3过表达可抑制3T3-F442A前脂肪细胞中的脂质积累，其中以Smad3的作用更显著；同时，失活的Smad3可抑制TGF-β信号在脂肪生成中的抑制作用，Smad2则无此作用，表明Smad3可抑制TGF-β通路中的脂肪细胞分化[25]。

2.5TGF-β在肌腱细胞分化中的作用 肌腱是一种具有独特功能的组织，其中Ⅰ型胶原排列成分层的纵向原纤维阵列，并由内腱结合成束，而内腱与血管系统、神经支配和淋巴管穿过的表腱相连。作为肌腱祖细胞的标志物，SCX(scleraxis)基因在肌腱间充质分化中具有重要作用，且持续存在于成熟的肌腱细胞中[28]。虽然目前关于MSCs向肌腱细胞分化的研究仍不够完善，但MSCs向肌腱细胞分化的过程与TGF-β、BMP及Smad通路有关。

TGF-β家族成员在肌腱细胞分化和肌腱细胞表型的维持中均发挥重要作用。其中，BMP-2、BMP-4和BMP-7是可抑制肌腱细胞分化作用的蛋白，而BMP-14、BMP-13和BMP-12可诱导动物模型新肌腱形成[29]；TGF-β可促进SCX表达并维持肌腱细胞表型；Smad在由拉伸和压缩力产生的相关基因表达中发挥重要作用，由此可见，TGF-β家族成员对肌腱细胞的形成和再生均至关重要[30]。由于肌腱在肌肉骨骼系统中具有独特的作用，在保持灵活性的同时还可维持压缩和伸展的动态范围，因此物理力在肌腱细胞分化和功能中起重要作用。研究表明，TGF-β2可诱导MSCs向肌腱细胞谱系方向分化；在机械力作用下，TGF-β3可促进SCX表达并诱导肌腱细胞分化[31]。Smad(特别是Smad2和Smad3)是调节肌腱基因表达所必需，且这种基因表达由作用于肌腱组织的物理力诱导，其中Smad8已被证明在MSCs的肌腱分化中发挥作用[32-33]。

3 小 结

TGF-β家族对间充质谱系选择和分化进展的影响较复杂，且依赖于时间、剂量以及所处的环境。此外，某些TGF-β蛋白对于MSCs分化过程中的不同阶段也有不同的影响，如TGF-β可促进MSCs增殖以及早期分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞祖细胞等，但却抑制后期分化为成熟的成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞；此外，TGF-β还可抑制成肌细胞增殖、分化和肌管形成。因此，药理学靶向TGF-β家族成员有益于某些疾病的治疗，如骨骼及关节相关疾病。TGF-β信号通路在MSCs分化中具有重要作用，但将研究成果向临床转化还需更深入的研究以确定其有效性及安全性。