袁华，李宁，吴令英

国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院妇瘤科，北京 100021

卵巢癌是最常见的妇科生殖系统恶性肿瘤之一。2020 年全球估计新发卵巢癌31.4 万例，病死20.8 万例[1]。2015 年中国癌症统计数据显示，中国每年新发卵巢癌超5.2 万例，病死超2.3 万例，且呈明显上升趋势[2]。既往研究发现，卵巢癌的发生与DNA 双链损伤修复缺陷密切相关。

DNA 双链损伤修复维持着基因组稳定和细胞的生存。G1期细胞周期的经典非同源末端连接修复（classical non-homologous end-joining，C-NHEJ）和S/G2期的同源重组修复是主要的DNA 损伤修复方式。同源重组修复是高保真的DNA 双链损伤修复。乳腺癌易感基因（breast cancer susceptibility gene，BRCA）1、BRCA2、RAD50、RAD51、RAD51C、PALB2、FANCA、ATM、ATR、细胞周期检测点激酶（cell cycle checkpoint kinase，CHEK）1、CHEK2等均是同源重组修复的重要基因。同源重组修复基因若出现异常，会导致细胞同源重组修复缺陷（homologous recombination deficiency，HRD），细胞会采用其他易错的修复方式进行DNA 损伤修复，进而导致基因组不稳定，促进肿瘤的发生[3]。同源重组修复缺陷细胞对铂类化疗药物及其他诱导DNA双链损伤的药物具有较高的敏感性[4]。15%～20%的上皮性卵巢癌患者携带BRCA1/2胚系突变（10%～15%）或体细胞突变（6%～7%），约10%的上皮性卵巢癌患者的BRCA1基因启动子存在过甲基化[5]，而其他同源重组修复基因的突变频率为4%～5%[3]。

多腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]抑制剂是主要针对BRCA1/2突变或HRD卵巢癌的靶向治疗药物，作用于BRCA1/2异常或HRD 卵巢癌细胞后，细胞DNA 单链损伤不能被修复，可促进DNA 双链损伤、断裂的发生，引起DNA 复制叉停止，导致合成致死，从而靶向杀灭肿瘤细胞[4]。多项临床试验证实，PARP 抑制剂对BRCA1/2突变或HRD 卵巢癌患者具有较好的疗效，特别是用于铂敏感复发卵巢癌患者的维持治疗、BRCA1/2突变晚期卵巢癌的一线维持治疗及后线治疗等[6-14]。此外，PARP 抑制剂在乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌的治疗中也显示出了令人满意的疗效。目前，已被美国食品药品管理局（FDA）批准的PARP抑制剂包括4种，即奥拉帕利（Olaparib）、卢卡帕利（Rucaparib）、尼拉帕利（Niraparib）、他拉唑帕利（Talazoparib），其中奥拉帕利、尼拉帕利已经在中国上市。国产PARP 抑制剂——氟唑帕利也已经被批准用于伴有胚系BRCA1/2基因突变的铂敏感复发卵巢癌的后线治疗。因此，将会有更多的肿瘤患者从PARP 抑制剂的治疗中获益[15]。

但部分携带同源重组修复基因突变的上皮性卵巢癌或其他肿瘤患者对PARP 抑制剂原发或获得性耐药[16-17]。已有研究发现了PARP 抑制剂耐药的机制，主要集中于细胞同源重组修复功能的恢复。同源重组修复通路上的重要基因（BRCA1/2、RAD51、PALB2等）通过继发性逆转突变或基因内缺失恢复相应蛋白的功能，可再次激活同源重组修复功能，进而导致PARP 抑制剂耐药。本文将对卵巢癌同源重组修复基因逆转突变导致PARP 抑制剂耐药的研究进展进行综述。

1 同源重组修复基因逆转突变

2008 年，Edwards 等[18]利 用 携 带BRCA2c.6174delT 移码突变的人胰腺癌细胞Capan-1，衍生出PARP 抑制剂耐药克隆的细胞。该研究发现，耐药克隆的细胞可以形成DNA 损伤诱导的RAD51核聚集灶，能够抑制细胞毒性药物诱导的基因组不稳定。进一步研究提示，耐药细胞系出现继发性基因内缺失，可形成逆转突变，恢复BRCA2的开放阅读框，进而恢复部分BRCA2的功能。随后，多项研究在临床接受化疗或PARP 抑制剂治疗的肿瘤患者中同样发现，肿瘤组织中继发性同源重组修复基因逆转突变是重要的耐药机制。

Norquist 等[19]研究发现，BRCA1/2逆转突变 与化疗耐药相关。该研究通过对携带BRCA1/2胚系突变的64 例初治卵巢癌和46 例复发卵巢癌患者的肿瘤组织进行BRCA1/2突变检测，结果发现，46例复发卵巢癌中有13 例（28.3%）存在逆转突变，而64 例初治卵巢癌仅2 例（3.1%）存在逆转突变（P＜0.01）。该研究26 例铂类耐药的复发患者中有12例（46.2%）存在继发性BRCA1/2逆转突变，而19 例铂类敏感复发患者中仅有1 例（5.3%）存在继发性BRCA1/2逆转突变（P=0.003）；结合功能试验提示，携带BRCA1/2胚系突变患者的卵巢癌组织继发性体细胞逆转突变可恢复BRCA1/2的功能，逆转突变的存在可预测机体对铂类药物及对PARP 抑制剂的耐药性。

Lheureux 等[20]在1 例长期（＞7 年）接受奥拉帕利治疗获益的BRCA1基因胚系野生型的铂敏感复发性卵巢高级别浆液性腺癌患者中发现，该患者在最初诊断时肿瘤组织中野生型BRCA1基因等位基因缺失、另一等位基因携带W353*无义突变，且肿瘤组织中缺乏能够恢复BRCA1 蛋白活性的等位基因，提示该患者可能会被治愈。因此，研究者认为肿瘤组织中BRCA1/2双等位基因缺失/异常可能是对PARP 抑制剂长期敏感的潜在标志。Barber 等[21]通过对奥拉帕利耐药的乳腺癌、卵巢癌患者治疗前后穿刺肿瘤组织标本进行大规模平行测序发现，患者均存在BRCA2逆转突变，这些突变能够恢复BRCA2 蛋白的功能。Waks 等[22]纳入8 例接受PARP 抑制剂和化疗耐药的转移性乳腺癌患者，患者均携带BRCA1/2突变，收集患者治疗前后肿瘤组织或细胞游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）标本，通过测序发现，8 例患者中4 例存在BRCA1/2逆转突变，提示逆转突变可能是乳腺癌对PARP 抑制剂、化疗耐药的重要机制。

除BRCA1/2基因外，同源重组修复的其他基因的逆转突变也与PARP 抑制剂耐药相关。Kondrashova 等[23]研究发现，卢卡帕利耐药的复发卵巢癌患者肿瘤组织中存在RAD51C和RAD51D基因逆转突变，这些逆转突变能够恢复开放阅读框；进一步的功能研究证实，卢卡帕利耐药与这些逆转突变相关。

除卵巢癌、乳腺癌外，胰腺癌患者中继发性同源重组修复基因体细胞逆转突变也与PARP 抑制剂耐药相关。研究显示，1 例63 岁胰腺导管腺癌患者携带BRCA26714 位碱基缺失突变，在接受PARP抑制剂治疗后逐渐出现耐药，研究者在耐药肿瘤细胞中检测到了BRCA2继发性逆转突变，该逆转突变能够恢复BRCA2 蛋白的功能[24]。

2 cfDNA 检测逆转突变

检测cfDNA中突变是近年来逐渐兴起的重要的疗效监测手段。多项研究对患者外周血cfDNA 的检测发现，同源重组修复基因继发性逆转突变与PARP 抑制剂耐药相关，这为动态监测PARP 抑制剂的疗效提供了可能。Christie 等[25]的研究共纳入30 例携带BRCA1/2胚系突变的卵巢高级别浆液性腺癌患者，包括14 例初治患者和16 例复发患者，其中24 例患者采集到配对的肿瘤组织和血浆标本。该研究结果显示，5 例患者出现基因内逆转突变，恢复BRCA1/2开放阅读框，且这5 例患者均为复发患者；5 例患者中3 例患者同时在配对的血浆cfDNA 中检测出基因内逆转突变，这些患者对PARP 抑制剂耐药。Weigelt 等[26]前瞻性纳入24 例BRCA1/2胚系突变的卵巢癌、乳腺癌患者，包括19例铂耐药/难治性卵巢癌患者和5 例拟接受铂类化疗和（或）PARP 抑制剂治疗的转移性乳腺癌患者，该研究对患者血浆cfDNA 进行大规模平行测序结果显示，在4 例卵巢癌患者（21%）和2 例乳腺癌患者（40%）血浆cfDNA 中检测出了多样化、多克隆的BRCA1/2逆转突变，其中1 例乳腺癌患者在PARP 抑制剂治疗前cfDNA 中就检测出了逆转突变，该患者对PARP 抑制剂原发耐药，PARP 抑制剂治疗后cfDNA 中逆转突变进一步富集；功能研究表明，部分逆转突变可恢复BRCA1/2 蛋白的功能。Lin 等[27]对携带BRCA1/2胚系或体系突变的卵巢高级别浆液性腺癌患者治疗前和进展后血浆cfDNA 进行测序分析，结果发现，铂难治、铂耐药复发、铂敏感复发卵巢癌患者cfDNA 中逆转突变率分别为18%（2/11）、13%（5/38）、2%（1/48），差异有统计学意义（P=0.049）；在卢卡帕利治疗患者中，治疗前cfDNA 中无BRCA1/2逆转突变患者的中位无进展生存期（progression-free survival，PFS）明显长于有逆转突变患者（9.0 个月vs1.8 个月，HR=0.12，P＜0.01）；对78 例疾病进展患者的cfDNA 进行测序发现，8 例患者具有BRCA1/2逆转突变。

ARIEL2 研究发现，复发性卵巢癌患者卢卡帕利治疗前cfDNA、肿瘤组织中共检测出10 例（8.9%，10/112）患者存在BRCA1/2逆转突变，这10例患者对卢卡帕利均不敏感，包括6 例疾病进展、4例疾病稳定，中位PFS 为1.8 个月（95%CI：1.7～5.4个月）[28]。ARIEL4 研究中共有23 例（6.6%）患者携带BRCA1/2基因逆转突变，进一步分析发现，与化疗患者（n=10）相比，卢卡帕利治疗患者（n=13）的中位PFS 更短（2.9 个月vs5.5 个月，HR=2.769，95%CI：0.989～7.755），该 研 究 也 是 第 一 项 证 实BRCA1/2基因逆转突变可预测PARP 抑制剂耐药的前瞻性随机研究[29]。

此外，在前列腺癌患者血浆cfDNA 中也发现了BRCA2、PALB2基因逆转突变与奥拉帕利耐药相关[30-31]。

3 逆转突变的形成机制

Tobalina 等[32]对近年来发表的BRCA1/2逆转突变相关文献进行总结，共纳入327 例患者，其中卵巢癌234 例、乳腺癌27 例、胰腺癌13 例、前列腺癌11 例、原发灶不明肿瘤42 例，结果显示，327 例患者在接受铂类药物或PARP 抑制剂治疗后均出现耐药，其中26%（86/327）患者携带BRCA1/2逆转突变，对这些存在逆转突变的患者进一步分析发现，BRCA1/2基因11 号外显子编码的大多数氨基酸序列对产生铂类化疗或PARP 抑制剂耐药不是必要的；此外，该研究还发现，BRCA1/2基因内缺失导致逆转突变形成位点的周围具有DNA 微同源序列的显著累积，尤其是BRCA2，这种微同源序列的形成与选择性非同源末端连接（alternative non-homologous end-joining，Alt-NHEJ）修复有关。表明抑制Alt-NHEJ 修复可减少逆转突变的形成，延长PARP抑制剂的持续时间。Alt-NHEJ 是一种独特的DNA损伤修复方式，其与同源重组修复机制具有相同的底物，但Alt-NHEJ 是一种易错的修复机制，具有高度的诱变性，会引起染色体重排[33-35]。研究认为，Alt-NHEJ 是一种补充修复机制，在正常细胞中，同源重组修复抑制Alt-NHEJ 修复机制，而当肿瘤细胞同源重组修复和C-NHEJ 修复异常时，细胞的DNA 双链破坏主要通过Alt-NHEJ 机制修复，进而得以存活[33-34]。微同源末端连接（microhomology-mediated end-joining，MMEJ）是Alt-NHEJ 最重要的修复方式。BRCA1/2等同源重组修复基因缺陷卵巢癌细胞的存活依赖MMEJ 修复，这种易错的修复方式会导致同源重组修复基因逆转突变，进而对PARP 抑制剂耐药。因此，抑制MMEJ 修复是克服PARP 抑制剂耐药的重要方式。

4 逆转PARP 抑制剂耐药

POLQ基因编码的Polθ蛋白（polymerase θ）是一种多功能酶。Polθ同时具有DNA 聚合酶和解旋酶的功能，是Alt-NHEJ 修复机制中重要的蛋白[36]。POLQ基因在细胞中重要的功能是参与MMEJ 修复。抑制肿瘤细胞Polθ的功能可减少MMEJ 修复，进而有效抑制因同源重组修复基因逆转突变而导致对PARP 抑制剂耐药。

Zatreanu 等[37]通过细胞和动物实验发现，Polθ聚合酶变构抑制剂——ART558，能够抑制Polθ介导的DNA 损伤修复，ART558 能够在BRCA1/2突变肿瘤细胞中诱导DNA 损伤和合成致死效应，并增强PARP 抑制剂的作用。Zhou 等[38]通过高通量小分子筛选发现，抗生素新生霉素（novobiocin，NVB）是Polθ的一种特异性抑制剂，可在体外和体内选择性地杀死HRD 肿瘤细胞；NVB 可直接与Polθ蛋白的ATPase 结构域结合，抑制其ATPase 活性，并消耗Polθ；NVB 在转移瘤模型中可杀死HRD的乳腺癌和卵巢癌细胞，PARP 抑制剂获得性耐药的BRCA缺陷肿瘤细胞对NVB 治疗敏感。表明NVB 单独或与PARP 抑制剂联合均可用于HRD 肿瘤的治疗，包括PARP 抑制剂获得性耐药的肿瘤患者。Pettitt 等[39]通过生物信息学软件NetMHCpan 4.0 对BRCA1/2基因逆转突变序列进行分析发现，这些逆转突变可编码新的抗原，因此，这些逆转突变患者可能会从嵌合抗原受体T 细胞疗法（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）、免疫检查点抑制剂或抗肿瘤疫苗的治疗中获益。期待未来Polθ抑制剂或BRCA1/2基因逆转突变的新抗原能够有效改善PARP抑制剂耐药患者的预后。

Kim 等[40]在铂耐药和继发性PARP 抑制剂耐药患者的移植瘤模型中都观察到了PARP 抑制剂联合共济失调毛细血管扩张和Rad3 相关激酶（ataxia telangiectasia and Rad3-related kinase，ATR）抑制剂的持久疗效；且PARP-ATR 抑制剂对BRCA1/2基因逆转突变引起的PARP 抑制剂耐药模型同样具有良好的疗效。因此，PARP-ATR 抑制剂是一种非常有前景的治疗策略。由于PARP-ATR 抑制剂在基础研究中的良好疗效，Shah 等[41]和Wethington 等[42]开展了PARP-ATR 抑制剂相关的CAPRI 研究，该研究旨在评价ATR 抑制剂（AZD6738）联合PARP 抑制剂（奥拉帕利）治疗复发性卵巢癌的疗效，其中队列C 是探讨奥拉帕利联合AZD6738 在PARP 抑制剂获得性耐药的复发性卵巢癌中的疗效，共纳入13 例既往接受PARP 抑制剂治疗进展的铂敏感复发性卵巢高级别浆液性癌患者，其中9 例为BRCA1/2胚系突变，3 例为BRCA1/2体系突变，1 例为HRD 阳性，既往PARP 抑制剂治疗的中位时间为13 个月（4～60 个月）。上述CAPRI 研究结果显示：患者的客观缓解率为46.2%（6/13），6 例患者均为部分缓解，PFS 为7.5 个月（95%CI：4.7～NR），没有患者因不良反应退出研究。该研究表明奥拉帕利联合AZD6738 具有良好的耐受性，首次提出了ATR 抑制剂在HRD 患者中逆转PARP 抑制剂耐药性的潜力。

此外，其他针对PARP 抑制剂耐药性的研究也在进行中，包括WEE1 抑制剂、DNA 依赖性蛋白激酶抑制剂等[43-44]。但因同源重组修复基因逆转突变导致对PARP 抑制剂耐药的患者能否从这些药物中获益尚不清楚。

5 小结与展望

综上所述，BRCA1/2、RAD51、PALB2基因通过继发性逆转突变恢复同源重组修复功能是PARP抑制剂耐药的重要机制。Polθ、ATR 抑制剂等对这些PARP抑制剂耐药肿瘤患者具有良好的疗效。随着越来越多的患者接受PARP 抑制剂治疗，动态监测PARP抑制剂治疗患者血浆cfDNA中基因突变情况，有助于指导临床对肿瘤患者进行精准治疗，评估临床疗效及患者的预后。