崔 伟,张志伟,杨二霞,姜 莉

(艾美康淮生物制药(江苏)有限公司,中国江苏 泰州 225300)

固有淋巴细胞(innate lymphoid cells,ILCs)来自共同淋巴样祖细胞(common lymphoid progenitor,CLP),是一群具有获得性免疫功能的天然淋巴细胞家族。ILCs广泛分布于肺部、结肠、口腔黏膜、淋巴结,甚至胚胎组织[1]。其主要对寄生虫感染及病原体胞内感染产生免疫反应[2],同时对机体抵抗感染所诱发的炎症反应进行调节,以维持和重建屏障系统[3]。此外,ILCs在非淋巴系统中的分布,预示其不仅具有抗炎作用,亦可能对组织的发育、完整性及稳态具有重要作用。当病原体入侵机体时,ILCs由于分布的位置优势往往成为与病原体率先发生作用的细胞之一,并由此引发获得性免疫。本文主要就ILCs细胞亚群的不同表型的功能特性及其在抗病毒感染中的作用等研究进展进行综述。

1 ILCs的表型、发育及功能特点

成熟的ILCs具有3个典型特征:缺乏重组激活基因(recombination activating gene,RAG)依赖的抗原受体重排;缺乏其他淋巴细胞和髓系相关细胞表面标记物;不表达T细胞或B细胞受体(T/B cell receptor,TCR/BCR)。根据ILCs效应功能、所分泌细胞因子及表达的转录因子的差异,其分为3种类型:Ⅰ型ILCs、Ⅱ型ILCs、Ⅲ型ILCs。Tufa等[4]将获得CD48和CD52的人类CLPs(CD34+CD117+α4β7+Lin-)定义为 ILC 前体(ILC precursors,ILCps)和 NK 祖细胞(NK progenitors,NKPs)。ILCps存在于 CD34+CD117+α4β7+Lin-CD48+CD52+亚群中,能分化发展为ILC1s、ILC2s和NCR+ILC3s。因此,在细胞因子和表面受体信号的调节指导下,先天性淋巴祖细胞会发展不同亚型的ILCs[5]。

Ⅰ型ILCs包括经典的自然杀伤细胞(natural killer cells,NK cells)和ILC1。NK细胞表达Eomes和T-bet转录因子,与细胞毒性CD8+T细胞相似。ILC1是非细胞毒性的Ⅰ型ILCs,由白细胞介素-12(interleukin-12,IL-12)、IL-15、IL-18[6]激活后产生γ 干扰素(interferon-γ,IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),表型为 T-bet+Eomes-,在功能上与CD4+T辅助细胞1型(Th1)相似[7]。Ⅰ型ILCs参与Ⅰ型天然免疫应答,具有抗胞内病原体感染(如病毒感染)和抗肿瘤免疫功能[7]。

ILC2由IL-33、胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoietin,TSLP)、IL-25 激活,产生的细胞因子部分与CD4+Th2相似,如IL-5、IL-9和IL-13[8]。其发育及成熟需要转录因子α型维A相关孤儿受体(retinoid orphan nuclear receptor α,RORα)[9]和 B 细胞淋巴瘤/白血病 11B(B cell lymphoma/leukemia 11B,Bcl11b)的辅助[10],在2型天然免疫反应中发挥重要作用,参与胞外寄生虫感染和过敏反应。此外,有研究表明,ILC2分泌的双调蛋白(amphiregulin,Areg)参与组织损伤修复[11]。

Ⅲ型ILCs包括ILC3和淋巴组织诱导细胞(lymphoid tissue inducer cells,LTi)。根据趋化因子受体CCR6的表达差异,Ⅲ型ILCs可分为CCR6-ILC3、CCR6+LTi[12],其中,LTi细胞又可分为CD4+LTi细胞或CD4-LTi细胞[13]两个亚群,CCR6-ILC3细胞则可根据NK细胞毒性受体(natural killer cell receptor,NCR)[14]的表达进行细分。ILC3可被IL-23 和 IL-1β[6]激活,表达 RORγt,分泌 IL-17、IL-22、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocytemacrophage colony stimulating factor,GM-CSF)和效应细胞因子TNF-α[15]。ILC3的功能与Th17细胞相似,在抗细胞外微生物感染(如细菌和真菌感染)中承担着重要角色。

Eken等[16]将人类ILCs表型做出定义,ILC1为Lin-cKit-CRTH2-CD127+CD161+CD3-,ILC2为Lin-CRTH2+CD127+CD161+CD3-,ILC3为Lin-cKit+CRTH2-CD127+CD161+CD3-。但是,ILCs分组不是绝对的[17],因为ILC2和ILC3在一定的条件下都可以转化为ILC1[18],且ILC1与ILC3在发育过程中所依赖的转录因子部分相似,这可能预示着ILCs具有一定的可塑性。例如,小鼠体内的早期Lin-CD127+Flt3-淋巴祖细胞,可以分化出所有的ILCs亚群[19],面对环境刺激时,会分泌细胞因子、神经肽、激素等[20]。总体而言,这些ILCs群体在不同物种及不同组织中的表达具有差异性,对其表型描述的探索研究仍在继续,相信随着研究的不断深入,其表型将更加明确。

2 ILCs在抗病毒感染中的作用

研究表明,ILCs可以促进与病毒感染相关的天然免疫和获得性免疫[21]。但ILCs亚群放大或限制免疫应答的具体机制目前尚不明确。根据已有研究资料,我们将ILCs对不同病毒感染的免疫应答方式进行整理和介绍。由于NK细胞和LTi细胞的免疫功能已有相关综述报道,本文着重综述ILC1、ILC2和ILC3亚群在抗病毒感染中的效用。

2.1 ILCs与严重急性呼吸综合征冠状病毒2

有别于其他病毒,严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe scute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)的病毒载量无法作为区分病症严重程度的指标,例如:轻症儿童的病毒载量可能会与重病成人相当[22]。研究发现,新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的严重程度仅受年龄依赖性的疾病耐受机制影响,而ILCs等淋巴细胞,与促进疾病耐受性有密切关联[23]。也有研究者发现,COVID-19重症患者除了呼吸窘迫、缺氧、器官衰竭等病症外,过度激活的免疫反应也可能发生,从而触发全身性细胞因子风暴循环障碍,导致循环休克[24～26]。因此,有理由相信ILCs能在COVID-19的诊断和治疗中承担一定作用。

Silverstein等[23]的研究显示,ILCs丰度与COVID-19患者的住院需求、住院时间和炎症严重程度有关。同龄、同性别的健康人群的ILCs丰度是COVID-19住院患者的1.78倍(95%CI:2.34～1.36;P=4.55×10-5);住院患者的ILCs丰度每增加两倍,住院时间减少9.38 d[23]。Kuri-Cervantes等[27]研究发现,COVID-19重症患者的ILCs水平异常,表现为远低于中症、康复和健康对照人群。García等[28]发现,中、重症患者体内总CD127+ILCs和ILCps下降,ILC1丰度相对保持不变,但ILC2却有所区别;总ILC2和CD117-ILC2在中度患病组升高,却在重度COVID-19患者中下降。其原因可能是ILC2的趋化因子受体(CXCR3和CCR6)表达失调。同时,ILC2与系统性生物标志物(D-二聚体凝血因子)水平、器官/肌肉损伤标志物(肌红蛋白、肌钙蛋白T、乳酸脱氢酶)水平以及症状出现后的天数呈负相关,说明低水平的ILC2是病情加重的重要标志。Zizzo等[29]报道,IL-33是驱动COVID-19所有阶段(即无症状、轻度-中度、重度-临界和慢性-纤维化)的关键因素:IL-33诱导ILC2的分化,转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)增强ILC2上ST2的表达,促进IL-9的产生。效应记忆Vγ9Vδ2+T细胞因IL-9反刺激作用得到扩张增殖,表达CXCR3,并被CXCL9和CXCL10募集到肺部;IL-33-ST2会增加表达GM-CSF的T细胞数量,抑制抗病毒干扰素反应,引发过度炎症,并促进血栓形成。也有研究表明,IL-18刺激并诱导NKG2D+ILC2表达增加,NKG2D+ILC2在NKG2D受体与其配体结合时产生抗炎介质,有利于终止炎症[30]。综上可知,ILCs在COVID-19患者病情诊断与减少重症患者高死亡率背后发挥着重要作用。

2.2 ILCs与呼吸道合胞病毒

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染在婴幼儿和老年人群体中有较高的发病率与死亡率,严重威胁着公众的健康。通常情况下,RSV率先感染肺部上皮细胞,严重的RSV感染可以引起气管上皮细胞破坏及脱落黏液生成、细支气管炎症及肺功能障碍[31]。已有研究表明,肺部驻留的ILC2是RSV感染早期IL-13的主要来源,ILC2很大程度上通过TSLP依赖性机制分泌IL-13。TSLP通过与ILC2表面的TSLP受体结合,直接作用于ILC2,使其增殖并分泌IL-13、IL-5。但在体外环境下TSLP不能直接激活ILC2,这表明在体内环境中TSLP对ILC2的激活需要其他信号分子的协同作用[32],例如:IL-33、IL-25、促炎分子[如半胱氨酸白三烯(白三烯D4)]和TNF家族细胞因子(尤其是 TLIA)[33～34]。另外,Stier等[35]的研究报道,在RSV感染过程中,信号转导及转录激活因子1(signal transduction and activator of transcription 1,STAT1)通过调控IL-33和IL-23进而调控ILCs的应答,STAT1信号通路可通过多种机制发挥ILC1的抗病毒作用,并抑制免疫病理相关的ILC2和ILC3反应。因此,在RSV感染过程中,ILCs所诱发的协同免疫效应使机体在清除病毒的同时,也可能限制免疫病理反应。但刺激ILCs活化所需的细胞因子网络有待进一步研究。

2.3 ILCs与流感病毒

流感病毒感染小鼠会导致肺部ILCs的累积,具体表现为:流感病毒感染诱导肺泡巨噬细胞、树突状细胞(dendritic cell,DC)分泌IL-33,进而诱导ILC2活化产生IL-5和IL-13,使肺内嗜酸性粒细胞聚集[36],从而诱导呼吸道高压反应[37]。Li等[36]研究表明,抗CD90.2处理可以使Rag2-/-小鼠体内的ILC2耗竭,抑制H3N1-诱导的呼吸道高压反应。这表明ILC2产生的IL-5和IL-13可能与哮喘加重有关。但ILCs缺失会导致气管上皮完整性丧失、肺功能下降和气管重塑受损。Vashist等[38]发现,在流感病毒感染两天后肺组织中的ILC1(分泌IFN-γ)会显著增加。而且,初次感染的小鼠肝脏内留存的记忆样ILC1被过继转移至感染流感的Rag1-/-小鼠体内后,会产生明显保护作用[36]。此外,甲型流感病毒虽然会刺激ILC2,引起急性气道高反应,但在感染恢复期,ILC2却发挥着治愈的作用,例如:ILC2分泌的Areg有助于促进肺稳态的形成[39]。ILC2对肺稳态的调节效应在Duerr等[40]的研究结果中亦有体现:流感病毒感染使ILC2表面标志分子GATA3及IL-33受体ST2表达降低,IL-33-IL-33R信号通路受损的小鼠在流感病毒感染后肺组织中的ILCs显著减少、肺功能和呼吸道上皮组织严重受损。综上所述,ILC2在流感病毒感染早期的快速增殖,使得炎性细胞聚集,从而引发一定的呼吸系统病理反应,但在恢复期对气管和肺部发挥稳态调节作用。因此,对ILC2的相关研究,有助于流感病毒感染的早期治疗和后期恢复。

2.4 ILCs与免疫缺陷病毒

肠道完整性丧失,伴有大量微生物产物快速地从肠腔转移到固有层、血液、淋巴结和肝脏,是人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)和猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus,SIV)的病原性感染特征之一。同时,产生的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、可溶性CD14分子(soluble cluster of differentiation 14,sCD14)等微生物易位标志物,激活机体免疫并产生炎症反应。ILCs(尤其是ILC3)在维持肠道组织建模、修复和完整性中发挥着重要作用[41],因此ILCs可能在HIV/SIV感染致病的病理生理学中,亦扮演着重要角色。

Xu等[42]通过研究感染SIV的恒河猴发现,黏膜组织ILC3表达高水平的RORγt,较NK细胞更早产生IL-17、IL-22和TNF-α。另有研究报道,感染 SIV 后,ILC3产生大量的 TNF-α、IFN-γ、人巨噬细胞炎症蛋白1β(macrophage inflammatory protein 1β,MIP-1β),但 IL-17 水平显著降低[43]。该结论在另一项研究中得以证实,在SIV急性致病性感染期间(感染后7～14 d),产生IL-17的ILC3显著减少,感染后14～21 d ILCs的总数量增加,感染后28 d ILCs再次减少并伴有病情恶化[44]。

Dillon等[45]研究发现,在HIV-1慢性感染未治疗期间,结肠中表达IFN-γ的炎症性NKp44+ILCs数量增多。Krämer等[46]却报道,HIV感染者体内ILCs的耗竭与CD127+ILC1和ILC3的减少相关。HIV在小鼠模型上的研究表明,持续的HIV-1感染会将ILC3耗尽,缺少ILC3导致感染者肠道内稳态难以维持,但有效的抗逆转录病毒疗法(antiretroviral therapy,ART)逆转了这一损失[47]。相同结论在Li等[48]的研究中也有提及,HIV患者血液中的3种ILCs亚群在感染后均被耗尽,但ART的早期应用使得所有ILCs亚群在耗尽后再次恢复;同时,该研究还发现,若感染后5～14 d内不给药,则只有ILC3部分恢复,ILC1和ILC2仍处于衰竭状态。不同的是,在HIV感染的哺乳期妇女血液中ILCs显著减少,但母乳淋巴细胞中的ILCs与未感染者无显著差异[49]。

HIV感染导致ILC3丢失并非由于直接感染,因为ILCs不表达SIV/HIV的受体,在这类细胞中人们也未能检测到SIV/HIV;进一步的研究发现,免疫缺陷病毒的黏膜急性感染导致ILC3丢失,是因为凋亡细胞增加、炎性细胞因子(如TGF-β、IL-2、IL-12、IL-15)抑制 RORγt表达[50]。Kløverpris等[51]也发现,在HIV-1急性感染期,ILCs表达的膜联蛋白V上调与细胞凋亡密切相关;ILCs丢失与CD69、组织归巢标志α4β7和Fas凋亡受体CD95高表达相关。Xu等[43]特别指出,慢性感染期微生物移位,使外周及肠道中脂磷壁酸和LPS等产物与ILC3表面Toll样受体2/4(Toll-like receptor 2/4,TLR2/4)结合,进而导致ILC3细胞凋亡,且ILC3的丢失与CD4+T、Th17、Th22细胞的减少具有一定的相关性。综上可知,HIV感染导致ILCs丢失与细胞凋亡有关。

2.5 ILCs与鼻病毒

鼻病毒(rhinovirus,RV)感染是儿童哮喘发作的重要诱因[50],但具体的发病机制目前尚不清楚。RV病毒可引起哮喘儿童PBMCs中IL-33、IL-25表达上调,此类细胞因子具有激活ILC2的效应[52]。患哮喘疾病的儿童在感染鼻病毒后,血液中ILC2标志分子ST2降低[53],这可能与血清中25(OH)-VitD3和ILC2活化相关的细胞因子IL-33发生中和作用有关[54]。上述分析表明,ILC2在儿童RV病毒感染诱发哮喘的过程中发挥着重要作用。

研究发现,IFN-γ可抑制RV感染的幼鼠体内的ILC2的增殖和IL-13的表达,减少黏液化生和哮喘发生[55]。还有研究发现,RORα抑制剂(SR-3335)可阻止RV诱导的肺组织中的ILC2增加[56],并抑制IL-13的表达[57],这可在一定程度上控制RV引起的哮喘表型。这些研究表明,对细胞免疫通路的深入研究将有助于识别预防哮喘的细胞和分子靶点。

2.6 ILCs与肝炎病毒

肝炎病毒感染已被认为是肝炎发展的一个关键因素,并导致持续性炎症状态,影响肝脏结构和功能。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)相关肝炎症的潜在分子机制主要涉及宿主对HBV病原体的免疫应答。在慢性乙肝病人肝组织中,ILC1分化相关的转录因子T-bet、效应分子IFN-γ、信号分子IL-12/IL-12R显著上升,相比之下,IL-33、ST2、GATA3、IL-13 等 ILC2 相关因子的升高程度均低于ILC1,且ILC2的活性与HBV拷贝数或肝损伤程度均无相关性[58]。研究发现,ILC1在慢性乙型肝炎发病机制中可能具有促炎作用[59];肝组织损伤后释放的IL-33可激活ILC2表达IL-13、IL-5,从而参与免疫介导型肝炎[60];ILC3分泌IL-22在急性肝炎中发挥保护作用[61]。在慢性丙型肝炎患者中,ILC1表达的NKG2A增加[62],抑制IFN-γ+NK细胞募集所需的CXCL9表达,而IFN-γ对DC细胞活化及病毒特异性CD8+T细胞启动至关重要。因此,阻断ILC1中NKG2A表达,使得DC细胞向肝组织靶向递送抗原,可产生持续的CD8+T细胞反应,从而显著提高疫苗的疗效,有利于肝组织病原体的清除。这为新型肝炎病毒疫苗的开发提供了新策略。

2.7 ILCs与肠道病毒

柯萨奇病毒A16型(Coxsackie virus A16,CA16)作为肠道病毒家族成员之一[63],与肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)类似,是引起儿童手足口病(hand,foot,and mouth disease,HFMD)的主要病原体,这两种病毒引起的HFMD病例达总病例的80%[64]。有研究发现,EV71病毒感染的重症患者PBMCs的ILC1(CRTH2-CD117+)增加,可能是ILC1的关键转录因子T-bet、GATA3和RORγt的高表达导致,而高频率的循环ILC1使得病毒性脑脊髓膜炎和病毒性脑炎风险提高2.9倍[65]。

为了弄清在CA16病毒和EV71病毒感染过程中ILCs发挥何种作用,以及CA16和EV71灭活抗原能否诱导核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信号转导通路激活并表达相关免疫信号分子,笔者团队进行了一系列基础研究,发现活病毒和灭活的病毒抗原均能使诱导ILCs活化所需的信号通路分子表达增加,进而使ILCs分泌的细胞因子(TNF-α、RANKL、GITRL 等)增加[66];CA16 和EV71病毒抗原与ILC1/ILC3分别存在共定位现象,病毒抗原进入呼吸道黏膜组织后,ILCs被明显激活[67]。此外,笔者团队还发现,将EV71和CA16抗原接种到上皮组织中能够诱导与ILCs有关的多种免疫信号分子的表达,如将抗原刺激传递至DC细胞。DC细胞和ILCs之间的协调作用有助于新生小鼠成功获得针对疫苗抗原的完整适应性免疫反应,并潜在地发挥着类似于自然病毒感染诱导的临床保护作用[68]。

3 总结与展望

ILCs作为一种新的非B、非T淋巴细胞,在进化起源、谱系特异性转录因子、发育功能方面与天然淋巴细胞和适应性淋巴细胞有极大的相似性。但ILCs主要作为屏障防御的管理者发挥作用,这使它们与适应性淋巴细胞不同。ILCs的发现和研究改变了人们对免疫调节以及免疫系统如何维持组织稳态的认识。ILCs是天然免疫细胞网络中必不可少的一类细胞,在抗病毒感染中发挥免疫保护和维持免疫平衡的作用,其激活和增殖依赖特定的细胞信号分子。ILCs被激活后产生的效应分子,是组织在病毒感染早期抵御病原体的关键信号因子,参与促进组织炎症或修复,但在病毒感染后的机体中,ILCs产生免疫应答的具体机制及其促进炎症或组织修复的分子途径尚待阐明。这些关键机制的研究将有助于加深人们对机体抗病毒免疫反应的认识,有助于提出更加有效的抗病毒策略。