杨玲钰,张 蕾

(武汉大学杂交水稻国家重点实验室,中国湖北 武汉 430072)

细胞自噬(autophagy)在真核生物中普遍存在,是一种依赖于溶酶体和液泡来降解细胞内物质或受损细胞器并回收必要营养物质的机制。目前,自噬被认为主要有巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和选择性自噬(selective autophagy)3种途径[1～2],其中巨自噬是最主要的自噬降解途径。巨自噬首先由一系列ATG(autophagy-related protein)蛋白及相关蛋白质在吞噬泡组装位点(phagophore assembly site,PAS)形成吞噬泡结构,进而吞噬胞内物质,产生具有双层膜结构且直径为400～900 nm的自噬体(autophagosome,AP),然后自噬体的外膜与溶酶体膜或液泡膜融合,内膜及内容物以自噬小体(autophagic body,AB)的形式被释放到溶酶体或液泡中,并最终在一系列水解酶的作用下被降解和循环利用[3～4]。微自噬则不形成独立双层膜结构,其通过溶酶体膜或液泡膜的直接内陷将待降解物包裹并降解[5]。选择性自噬是针对特异性的细胞成分,如细胞内需要清除的细胞器、大分子蛋白质复合体或入侵的病原菌等,由特定的分子伴侣蛋白(如HSC70和HSP90)介导的自噬途径,形成过程与其他两种自噬途径不同[2]。

细胞自噬存在复杂的分子调控机制,参与植物的生长发育、衰老、环境胁迫应答及免疫反应等多种过程。本文综述了近年来植物中细胞自噬的分子机制及生物学功能相关研究进展,旨在为植物细胞自噬相关研究提供参考。

1 植物细胞自噬的一般过程和分子机制

自噬的过程一般包括:自噬的诱导、泡状结构的成核、自噬体的形成和自噬体与液泡膜融合(图 1)。

在自噬过程中ATG蛋白发挥关键作用。拟南芥中已鉴定到的ATG基因有40种[6];水稻基因组中包含至少13个亚家族的33个ATG相关基因[7];此外,研究人员在烟草、玉米、苹果等植物中也分离鉴定出ATG相关基因[8]。根据自噬过程中功能的不同,ATG蛋白可分为4大类:1)ATG1/ATG13蛋白激酶复合体——参与细胞自噬的诱导;2)磷脂酰肌醇激酶复合体(phosphatidylinositol 3-kinase complex,PI3K complex)——参与泡状结构的成核;3)ATG9/2/18跨膜复合体(ATG9 complex)——参与自噬体形成和膜融合;4)类泛素结合系统(conjugation systems)——参与自噬体形成和膜融合[4](图1)。

图1 拟南芥自噬过程及核心复合物[4]Fig.1 The core autophagy machinery represented by the four main complexes in Arabidopsis thaliana[4]

1.1 细胞自噬的诱导

拟南芥中的ATG1/ATG13蛋白激酶复合体是自噬的核心组分,活性受上游激酶信号如TOR(target of rapamycin)激酶的调节。正常条件下,ATG13在TOR激酶复合体作用下维持高度磷酸化状态,与ATG1的结合能力弱,抑制自噬的产生;当植物处于胁迫条件时,TOR激酶失活,ATG13发生去磷酸化从而与ATG1的结合能力增强,激活ATG1激酶活性,使其发生自磷酸化,然后ATG1/ATG13与ATG11、ATG101形成复合体并连接到自噬体膜上,促进自噬体到液泡的转运[5]。研究表明,拟南芥SnRK1(sucrose non-fermenting 1-related protein kinase 1,酵母Snf1和哺乳动物AMPK的同源物)在TOR通路的上游激活自噬[9],其可能通过影响ATG1蛋白的磷酸化参与自噬的正向调控[10]。新近研究表明,SINAT(seven in absentia of Arabidopsis thaliana)家族蛋白会促进ATG13的泛素化,从而调节自噬[11～12](图 2)。

图2 拟南芥自噬过程中ATG1复合体的作用机制[12]正常条件下,TOR激酶维持ATG13的高度磷酸化状态,并与ATG1分离;TRAF1(tumor necrosis factor receptor associated factor 1)与SINAT1/2促进ATG13的泛素化和降解,使自噬通量维持在正常水平。胁迫条件下,SnRK1抑制TOR活性,导致ATG13去磷酸化,ATG1过度磷酸化,从而使ATG1与ATG13、ATG11、ATG101形成激酶复合物,启动自噬。Fig.2 The mechanism of the ATG1 complex in autophagy in A.thaliana[12]Under normal conditions,TOR kinase complex maintains ATG13 in a highly phosphorylated state,and the phosphorylated ATG13 is disassociated from ATG1.Tumor necrosis factor receptor associated factor 1(TRAF1)and SINAT1/2 promote the ubiquitination and degradation of ATG13,thereby maintaining autophagy flux at normal cell level.Under stress conditions,SnRK1 inhibits TOR activity,leading to ATG13 dephosphorylation and ATG1 hyperphosphorylation,which forms a kinase complex with ATG13,ATG11 and ATG101 to initiate autophagy.

1.2 泡状结构的成核

PI3K复合体介导囊泡成核。PI3K复合体被进一步区分为复合体Ⅰ和复合体Ⅱ,均含有3个核心蛋白质VPS34、VPS15和ATG6,此外复合体Ⅰ含有ATG14,而复合体Ⅱ含有VPS38。PI3K复合体和磷脂酰肌醇3磷酸盐(phosphatidylinositol 3-phosphate,PI3P)负责从头合成自噬体的修饰,PI3P招募ATG18-ATG2复合物到自噬体膜上,参与自噬体膜的延伸[13]。此外,PI3P也参与了自噬体沿着微管的转运[14]。

1.3 自噬体的形成以及与液泡膜的融合

自噬体的形成过程包含自噬体的延伸和闭合。ATG9是自噬过程中唯一的跨膜蛋白,为自噬体的形成提供膜源。已有研究表明,自噬过程中ATG9会与自噬体膜发生短暂的膜关联,调节植物内质网来源的自噬体形成[15];拟南芥ATG9与ATG11、PI3K共同调控ATG2介导的自噬体形成[16];ATG9还在ATG18a的转运过程中发挥重要作用[15]。

ATG8脂化系统和ATG12蛋白结合系统在自噬体形成过程中共同发挥作用。在自噬过程中,ATG8和ATG12与ATG7(具有泛素活化酶E1活性)结合,然后分别转移到ATG3和ATG10(具有泛素交联酶E2活性)上,并最终与底物连接,其中泛素化折叠蛋白ATG8与磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)结合,ATG12与ATG5耦联形成复合物,帮助自噬体进行延伸和融合[17]。在这个过程中ATG8的C端被ATG4识别并剪切(图3)。近期研究表明,H2S通过过硫化修饰抑制AtATG4a蛋白酶活性,从而负调控细胞自噬[18]。

图3 拟南芥自噬过程中类泛素结合系统的作用机制[4]两种类泛素结合系统作用下ATG5/ATG12和ATG8-PE复合物的形成过程。Fig.3 The mechanism of conjugation systems in autophagy in A.thaliana[4]Two ubiquitin-like conjugation systems prompt the formation of ATG5/ATG12 conjugate and ATG8-PE adducts.

研究发现,ATG5主要定位在内质网外表面,招募ATG8到已形成的自噬体。随着自噬体的延伸,定位在自噬体膜边缘的ATG5会形成一个环状结构,当自噬体的膜封闭起来时,ATG5离开新形成的自噬体,并且脱离内质网[19]。

拟南芥中还存在一种含有BAR结构域的非ATG蛋白SH3P2(SH3 domain-containing protein 2),在自噬诱导之前,SH3P2被招募到PAS并与磷脂酰肌醇磷酸(phosphatidylinositol phosphate,PIP)、PI3K复合体及ATG8结合,促进膜的延伸或成熟,参与膜的变形过程,进而促进自噬体的形成[20]。

另有研究报道,酵母SNARE复合体介导自噬体和液泡融合形成自噬小体,导致内容物在液泡中降解[21];酵母YKT6在拟南芥中的同源基因RabG3b参与植物管状细胞分化过程中的自噬,RabG3b-RNAi植株表现为细胞自噬缺陷[22]。

2 植物细胞自噬的生物学功能

2.1 自噬在植物生长发育中的作用

细胞自噬广泛发生于植物生长发育的各个阶段,在正常生长条件下,基础水平的自噬对维持细胞内稳态是必需的。

自噬参与调控植物叶片衰老。大多数atg突变体表现为正常的胚胎发育和营养生长,但具有典型的自噬相关表型,即叶片早衰[23]。在拟南芥中,15个ATG基因在衰老过程中表达上调[24]。在玉米[25]、苹果[26]、大麦[27]和大豆[28]中的研究也发现,ATG基因在衰老过程中表达增加。

自噬参与调控植物根的发育。研究发现,拟南芥中的细胞自噬可能参与根尖细胞生长及根毛分化[29]。此外,自噬在葡萄糖促进的根过氧化物酶体降解中发挥重要作用,并有助于葡萄糖介导的根分生组织的维持[30]。木胡杨的超微结构显示,自噬体在木质部、韧皮部组织(包括木纤维和木外纤维)的分化和早期发育过程中积累,暗示自噬参与了根的发育[31]。

自噬参与调控种子的发育。在拟南芥种子发育过程中,大多数ATG基因在角果中表达上调[32]。水稻Osatg7-1突变体胚乳中的淀粉降解途径被异常激活,种子呈白垩状,且粒型小,淀粉含量低,暗示自噬在胚乳的代谢调节中发挥重要作用[33]。玉米和拟南芥的atg突变体相比于野生型都产生更少的种子,而拟南芥的ATG过表达植株则增加了自噬,提高了种子产量和油脂积累[25,34]。

自噬参与调控植物生殖发育。拟南芥atg6突变体表现为花粉发育异常[35]。水稻atg7、atg9突变体也表现为显著的雄性不育,具体表现为在水稻花药发育过程中,自噬相关结构(自噬小体等)在四分体时期的数量极低,而在单核期被显著诱导[36];在Osatg7突变体中,多种与细胞器相关的基因以及参与碳水化合物/脂质代谢的基因的表达模式在花粉成熟过程中受到影响[37]。此外,有研究报道,烟草花粉萌发过程中需要自噬活动清除一些细胞质从而启动正常萌发[38]。

自噬参与调控植物发育过程中离子的供给。在拟南芥中,自噬参与调控硫从莲座叶到种子的代谢运输[39]。在拟南芥atg5-1突变体种子形成过程中,铁从营养器官到种子的转运严重减少;锌和锰在种子中的转运也依赖于自噬[40]。另有研究发现,在提高植物对锌的生物利用率以及缺锌条件下植物维持活性氧稳态方面,自噬也发挥着重要作用[41]。

2.2 自噬在植物营养循环中的作用

植物细胞能够在营养缺乏的情况下,通过自噬降解细胞结构或大分子物质,从而获得游离的营养和能量。多数atg突变体表现为对营养缺乏敏感。

烟草幼苗经自噬抑制剂处理或者直接沉默ATG基因会产生过度积累的淀粉,该现象在拟南芥atg突变体中同样存在,暗示自噬参与了植物淀粉的降解[42]。此外,过表达OsATG8a的植株在碳饥饿处理48 h时,OsATG1a/4a/8a/13a/16a和OsTOR基因的表达量均上调[43]。

研究发现,过表达MdATG18a促进自噬体的形成,增强了植物对氮缺乏的耐受性,并正调控花青素的生物合成[44];过表达MdATG9的苹果愈伤组织也表现为对氮缺乏的耐受[45]。

HY5是光信号的关键成分,它与组蛋白去乙酰化酶9(histone deacetylase 9,HDA9)相互作用并调控ATG5和ATG8e的表达,从而调控植物在光-暗转换和氮饥饿时的自噬作用[46]。

2.3 自噬在非生物胁迫中的作用

干旱会造成植物叶片气孔关闭及氧化损伤。在拟南芥中,atg5、atg7和RNAi-ATG18a植株对干旱胁迫敏感[47～48];在自噬缺陷的小麦和番茄中,研究人员也观察到类似的表型[49～50]。在苹果中,ATG18a的过表达则提高了自噬活性和抗旱性[51]。近期研究发现,当植物遭受干旱胁迫时,作用于正常植物生长的COST1蛋白会被降解,从而激活自噬通路,抑制植物生长,增强植株抗旱性[52]。

高盐是另一种植物易遭受的胁迫因子。水稻Osatg10b突变体对高盐更加敏感,其自噬小体的数目显著减少[53]。拟南芥atg对盐和渗透胁迫都十分敏感,细胞中被氧化的蛋白质降解受损;此外,盐胁迫下拟南芥的根皮层细胞中央液泡中Na+的限流需要自噬的调节[54]。

高温胁迫会导致植物蛋白质发生错误折叠和变性。在番茄中,高温诱导的自噬相关基因ATG5、ATG7、NBR1a和NBR1b在WRKY33a或WRKY-33b沉默植株中表达下调,同时,植株的耐热性降低[55]。拟南芥atg在中度高温(30℃)胁迫下几乎完全雄性不育,高温胁迫会诱导拟南芥中的花药壁细胞和小孢子发生自噬,引起氧化损伤并抑制绒毡层的程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)[56]。

淹水会导致植物细胞缺氧和过氧化物积累。水杨酸(salicylic acid,SA)信号转导突变体npr1和SA合成突变体sid2能够完全或部分恢复atg突变体对淹水敏感的表型,暗示在淹水环境下细胞自噬可以通过调节SA的水平来保护植物[57]。近期有研究表明,淹水诱导的拟南芥根系自噬对根系中的PCD有抑制作用[58]。

2.4 自噬在植物免疫中的作用

植物在受到病原菌侵染时能够激活自身的防御机制,通过侵染位点附近细胞的迅速坏死将病原菌限制在入侵部位,从而减少PCD,即诱导产生超敏反应(hypersensitive response,HR)[59]。自噬通过控制坏死细胞死亡的过程,并微调SA介导的免疫反应,影响植物基础免疫[60]。

拟南芥WRKY33是植物抵抗坏死性病原体的重要转录因子,它与细胞核中的自噬蛋白ATG-18a相互作用,参与植物对坏死性病原体的反应[61]。棉花CLCuMV病毒的毒力因子βC1直接与自噬的关键蛋白质ATG8f在自噬小体中相互作用,进而导致βC1分解[62]。在烟草中,胞质甘油醛-3-磷酸脱氢酶(cytosolic glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPC)通过与ATG3相互作用抑制自噬过程[63];而βC1可以阻断GAPC-ATG3的相互作用,并与GAPC相互作用激活自噬途径[64]。番茄TLCYnV复制启动子蛋白C1与ATG8h直接相互作用,导致C1从细胞核转移到细胞质,并通过自噬降解;自噬抑制剂处理或沉默ATG5、ATG7和ATG8h可促进茄科植物中TLCYnV的感染[65]。拟南芥中的BAK1(BRI1-associated receptor kinase 1)可以通过磷酸化ATG18a抑制细胞自噬途径,从而削弱植物对灰葡萄孢菌的抗病性[66]。

综上所述,自噬在植物生长发育、非生物胁迫及生物胁迫响应中都发挥着重要作用[67](图4)。

图4 植物细胞自噬的生物学功能[67]Fig.4 Biological functions of autophagy in plant cells[67]

3 总结

细胞自噬在营养物质缺乏或胁迫条件下对调节植物的生长十分重要,因此探究植物自噬分子机制意义重大。目前,植物细胞自噬研究取得了许多重要进展,很多研究方法也已成熟,但植物细胞自噬是一个复杂的过程,受到多种信号途径和激素的调节,许多植物中的ATG相关基因还未发掘,自噬在植物中的更多生物学功能也还有待探究。未来,需要在植物中继续分离鉴定新的自噬基因,从而更加清晰地阐明植物细胞自噬的分子机制。