张明康,周 燕,武新安,3

(1.兰州大学第一医院药剂科,中国甘肃 兰州 730000;2.兰州大学药学院,中国甘肃 兰州 730020;3.甘肃省临床用药风险防控工程研究中心,中国甘肃 兰州 730000)

尿酸性肾病(uric acid nephropathy)又称高尿酸血症肾病,主要由尿酸或尿酸盐晶体在肾脏沉积所导致[1]。尿酸主要由内源性和外源性嘌呤在黄嘌呤氧化还原酶(xanthine oxidoreductase,XOR)的作用下生成[2]。肾脏是尿酸的主要排泄器官,约70%的尿酸从肾脏排泄,其中超过90%被重吸收到肾近曲小管中[3]。目前,降低尿酸的药物主要有两大类:XOR抑制剂和促进尿酸排泄剂,它们在临床上的应用均可产生严重副作用。例如:别嘌呤醇(XOR抑制剂)会导致严重肝功能损害、胃肠道反应、药疹等;苯溴马隆(促进尿酸排泄剂)可导致肝肾损伤和过敏等严重的不良反应[2,4～5]。随着人们生活水平的提高,高嘌呤食物的摄入量明显增加,导致尿酸性肾病的发病率呈上升趋势[6],且发病年龄逐渐呈现年轻化趋势[5]。因此,研发出高效低毒甚至无毒副作用的新型降尿酸药物,引起了越来越多的关注。

近年来研究发现,肥大细胞与炎症和纤维化损伤密切相关,并且肥大细胞参与许多肾脏疾病的发生和进展[7],如马兜铃酸肾病[8]、肥胖相关性肾病[9]、IgA肾病[10]。但是,很少有研究报道肥大细胞与尿酸性肾病之间的关系,相关机制更是不明。因此,本研究使用腺嘌呤联合酵母粉模拟高嘌呤饮食,在健康雄性SD大鼠中制备慢性尿酸性肾损伤模型,初步探讨肥大细胞与尿酸性肾病之间的联系,为临床治疗尿酸性肾损伤提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性SD(sprague-dawley)大鼠24只,6～8周龄,体重(200±10)g,购自兰州兽医研究所实验动物中心,动物生产许可证号:SCXK(甘)2015-0001。大鼠饲养于兰州大学药学院动物房,室温25℃,昼夜12 h交替,可以自由进食、饮水。所有动物实验均经过兰州大学医学伦理委员会同意,实验方法符合动物医学伦理管理规范。

1.2 实验试剂与仪器

腺嘌呤(adenine,AD,北京索莱宝科技有限公司);谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)检测试剂盒、谷胱甘肽(glutathione,GSH)检测试剂盒和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所);大鼠血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒(上海酶联生物公司)。

OLYMPUS AU400全自动生化分析仪(OLYMPUS光学株式会社,日本);17/17R低温高速离心机(Thermo公司,美国);Smart WLI光学显微镜(GBS公司,德国);LT-224S分析天平(北京赛多利斯公司)。

1.3 实验动物分组与干预方法

SD大鼠适应性基础喂养1周后根据体重随机分为对照组和模型组,其中对照组6只,模型组18只。模型组以100 mg/(kg·d)腺嘌呤灌胃联合喂食含有10%酵母粉的饲料构建尿酸性肾病大鼠模型,分别连续干预14 d(AD-14d)、21 d(AD-21d)和28 d(AD-28d);对照组每天以1%阿拉伯胶灌胃,于28 d后取材。每天记录大鼠体重,并观察毛色及日常活动状况。

1.4 大鼠肾功能指标检测

每组大鼠于末次干预后禁食24 h,次日利用代谢笼收集各组大鼠24 h尿液,尿液标本以8 000 r/min离心10 min,收集上清。随后,腹腔注射3%的戊巴比妥钠麻醉大鼠,开腹,腹主动脉采血3 mL,血标本以8 000 r/min离心10 min,收集血清。以全自动生化分析仪检测血清肾功能指标血尿酸(serum uric acid,SUA)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、肌酐(serum creatinine,SCr)、胱抑素C(cystatin-C)以及尿尿酸(urinary uric acid,UUA)含量。

1.5 苏木精伊红染色观察大鼠肾脏组织病理学变化

采血结束后,断颈处死大鼠,立即采集肾脏组织,称量,记录肾总重。根据下述公式计算肾脏指数:肾脏指数=肾总重/体重。随后,将左侧肾脏组织置于4%中性多聚甲醛中固定24 h。制备常规石蜡切片,进行苏木精伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色,用中性树胶封片后置于光学显微镜下观察染色情况。

1.6 Masson染色观察大鼠肾间质纤维化程度

取各组大鼠肾脏组织石蜡切片,进行Masson染色,用中性树胶封片后,置于光学显微镜下观察染色情况。染色结果:胶原纤维呈蓝色,视为阳性着色,肌纤维呈红色。

1.7 大鼠肾脏尿毒素含量测定

采血结束后,断颈处死大鼠,立即采集肾脏组织。将右侧肾脏组织置于液氮中,然后精准称取适量肾脏组织于离心管中,加入蒸馏水,每个离心管中加入5个磁珠,充分匀浆后以8 000 r/min离心10 min,收集上清。采用超高效液相色谱-串联质谱(ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)技术检测大鼠肾脏中尿毒素含量。色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1 mm × 50 mm,1.8 μm),流动相组成为水(0.1%乙酸)和甲醇(体积比60∶40),流速为0.2 mL/min,柱温保持在30℃。样品溶液和标准溶液的进样体积均为10 μL。各尿毒素质谱检测条件见表1。

表1 各尿毒素质谱检测条件Table 1 Mass spectrometry detection conditions for different urinary toxins

1.8 甲苯胺蓝染色观察大鼠肾脏肥大细胞

取各组大鼠肾脏组织石蜡切片,经脱蜡、脱水后进行甲苯胺蓝染色,用中性树胶封片,置于光学显微镜下观察染色情况。连续观察5个视野(×200)统计肥大细胞数量,并取平均值。染色结果:肥大细胞呈紫红色。

1.9 大鼠血清AngⅡ含量检测

血清AngⅡ含量严格根据上海酶联生物公司试剂盒说明书进行检测和计算。

1.10 大鼠氧化应激指标检测

血清和肾脏组织中GSH、GSH-Px、SOD的含量严格根据南京建成生物工程研究所试剂盒说明书进行检测和计算。

1.11 数据统计学处理

用SPSS 21.0软件进行数据统计分析。实验中所有数据用平均值±标准差(±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,显著性水平为P＜0.05。采用GraphPad Prism 8.0软件制图。

2 结果

2.1 大鼠日常状况和肾脏形态

在造模过程中,模型组大鼠体重增加缓慢甚至减轻,精神萎靡,毛色棕黄,背脊弯曲,并随着造模天数增加,情况加重;对照组大鼠毛色均光滑润泽,精神活跃。在肾脏形态方面,模型组大鼠出现“大白肾”现象,即和对照组大鼠肾脏相比,模型组大鼠肾脏体积变大,外表面分布白色颗粒,肾脏变为棕黄色(图1A)。此外,和对照组相比,造模14 d、21 d和28 d大鼠的肾脏指数(肾总重/体重)均显著性增加(P＜0.01)(图 1B)。

图1 尿酸性肾病大鼠肾脏形态(A)各组大鼠肾脏外观形态;(B)肾脏指数。**:P＜0.01 vs.对照组。Fig.1 Kidney morphology in rats with uric acid nephropathy(A)The appearance of the rat kidney in each group;(B)The ratio of kidney mass to body weight.**:P＜0.01,compared with the control group.

2.2 大鼠肾功能指标检测结果

模型组大鼠分别喂养至14 d、21 d和28 d,对照组大鼠喂养至28 d,各组大鼠正常禁食24 h后,收集24 h尿液,同时经腹主动脉收集血清,检测各组大鼠 BUN、SCr、SUA、cystatin-C 和 UUA含量。检测结果如表2所示,与对照组相比,造模14 d、21 d和28 d大鼠的BUN和SCr含量均显著性升高(P＜0.01);造模21 d和28 d大鼠的血清cystatin-C水平显著性升高(AD-21d,P＜0.05;AD-28d,P＜0.01);造模14 d、21 d和28 d大鼠的SUA水平显著性升高,UUA水平显著性降低(AD-14d,P＜0.05;AD-21d 与 AD-28d,P＜0.01)。由上可见,模型组大鼠在造模14 d时BUN、SCr和SUA的水平显著高于对照组,且随着造模天数增加,上述肾功能指标(包括cystatin-C)的水平逐渐增加。此外,模型组血中尿酸水平显著升高,尿中尿酸水平显著降低,提示模型组大鼠肾脏功能受损,肾脏尿酸盐排泄发生障碍。

表2 各组大鼠肾功能指标含量Table 2 The contents of renal function indexes in each group of rats

2.3 大鼠肾脏组织病理学观察结果

为了证实模型组大鼠肾脏存在结构受损,尿酸盐排泄障碍,我们对各组大鼠肾脏组织进行了病理学显微观察和比较。HE染色结果如图2所示,对照组大鼠肾脏组织(肾小管、肾小球)大小和形态均正常;造模14 d的大鼠肾脏组织出现肾小管扩张,造模21 d和28 d的大鼠肾脏组织呈现肾小管扩张和尿酸盐晶体沉积,并且随着造模天数增加,上述病理情况更加严重。上述结果证明,模型组大鼠肾脏结构受损,并在功能上导致肾脏尿酸盐蓄积。

图2 HE染色观察各组大鼠肾脏组织切片(×200)图中黑色箭头指示肾小管扩张,黄色箭头指示尿酸盐晶体。Fig.2 HE staining of rat kidneys in each group(×200)The black arrows indicate the dilated renal tubules,and the yellow arrows indicate the urate crystals.

2.4 大鼠肾间质纤维化程度

为了进一步证实模型组大鼠肾脏结构受损,我们采用Masson染色来观察其肾间质纤维化程度。结果如图3显示,对照组大鼠肾间质仅见少量亮蓝绿色胶原纤维;模型组(AD-14d、AD-21d、AD-28d)大鼠肾脏组织均可见大量亮蓝绿色胶原纤维沉积且呈絮团状,提示其纤维化损伤严重并呈现时间依赖性。

图3 Masson染色观察各组大鼠肾脏组织切片(×200)Fig.3 Masson staining of rat kidneys in each group(×200)

2.5 大鼠肾脏尿毒素含量

鉴于模型组大鼠存在严重肾损伤,我们进一步比较了对照组和不同时间段模型组大鼠的肾脏尿毒素含量。检测结果如图4所示,与对照组相比,结合型尿毒素中D-犬尿酸和苯基-β-D-葡糖苷酸的含量在造模21 d和28 d时均显著性增加(P＜0.05);对甲酚葡糖苷酸的含量在造模28 d时显著性增加(P＜0.05);对甲酚硫酸盐的含量在造模21 d和28 d时显著性增加(P＜0.01);苯乙酰-L-谷氨酰胺的含量在造模21 d和28 d时显著性增加(P＜0.05或P＜0.01);马尿酸的含量在造模14 d、21 d和28 d时均出现显著性增加(P＜0.01);硫酸吲哚酚的含量在造模14 d、21 d和28 d均出现显著性增加(P＜0.05 或 P＜0.01)。同时,与对照组相比,游离型尿毒素中N-乙酰-L-精氨酸和三甲胺-N-氧化物的含量在造模14 d、21 d和28 d时均出现显著性增加(P＜0.01);N-肉桂酰甘氨酸和假尿苷的含量在造模14 d、21 d和28 d时均出现显著性增加(P＜0.05);L-甲基肌苷的含量在造模21 d和28 d时均出现显著性增加(P＜0.01)。上述结果说明,结合型和游离型尿毒素含量均因模型诱导时间的加长而增加,证明诱导时间的延长将导致尿酸性肾功能障碍的进一步恶化。

图4 各组大鼠肾脏尿毒素含量*:P＜0.05,**:P＜0.01 vs.对照组。Fig.4 The content of urinary toxin in the kidney of each group*:P＜0.05,**:P＜0.01,compared with the control group.

2.6 大鼠肾脏组织肥大细胞数量

为了考察肥大细胞是否参与尿酸性肾损伤,利用甲苯胺蓝染色,特异性识别肥大细胞。结果如图5A所示,对照组大鼠肾脏可见少量肥大细胞(黑色箭头所示),并且肥大细胞分布稀疏;在模型组中,肥大细胞主要分布在肾皮质、肾小管间质以及肾小球和血管周围区域,且呈聚集状态。进一步对各组肥大细胞的数量进行统计分析,结果如图5B所示,与对照组相比,造模14 d大鼠的肥大细胞数量有增加趋势但未出现显著性差异,而造模21 d、28 d大鼠的肥大细胞数量均出现显著性增加(AD-21d,P＜0.05;AD-28d,P＜0.01)。以上结果提示,随着造模天数增加,肥大细胞数量显著增加。AngⅡ的含量。结果如图6所示,与对照组相比,造模14 d大鼠血清AngⅡ含量没有显著性差异,然而在造模21 d和28 d的大鼠中,血清AngⅡ含量均出现显著性增加(P＜0.05)。

图5 各组大鼠肾脏肥大细胞的分布和数量(A)各组大鼠肾脏肥大细胞的分布;(B)各组大鼠肾脏肥大细胞的数量。*:P＜0.05,**:P＜0.01 vs.对照组。Fig.5 Distribution and number of mast cells in each group of rats(A)Distribution of renal mast cells in each group;(B)Mast cell numbers in renal of each group.*:P＜0.05,**:P＜0.01,compared with the control group.

图6 各组大鼠血清AngⅡ含量*:P＜0.05 vs.对照组。Fig.6 The serum Ang Ⅱ content in each group of rats*:P＜0.05,compared with the control group.

2.8 大鼠血清和肾脏氧化应激指标检测结果

AngⅡ作为肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)主要的功能性成分,可以促进活性氧的产生,继而加重氧化应激反应。为了进一步证明肥大细胞通过AngⅡ途径参与尿酸性肾损伤,我们检测了大鼠血清和肾脏氧化应激指标GSH、SOD和GSH-Px的含量。血清检测结果如

2.7 大鼠血清AngⅡ含量

当过敏原持续刺激机体时,肥大细胞会募集在组织或器官中并释放细胞内的各种活性递质,最终促进AngⅡ的产生。为了进一步证实肥大细胞参与尿酸性肾损伤,我们检测了各组大鼠血清表3所示,与对照组相比,造模14 d时,大鼠血清GSH和GSH-Px的含量有下降趋势但未出现显著性差异;造模21 d和28 d时,大鼠血清GSH和GSH-Px的含量显著性下降(AD-21d,P＜0.05;AD-28d,P＜0.01);各模型组大鼠血清SOD水平和对照组相比没有显著性差异。各组大鼠肾脏氧化应激指标的检测结果如表4所示,与对照组相比,造模14 d、21 d和28 d时,大鼠肾脏GSH的含量显著性下降(AD-14d,P＜0.05;AD-21d和AD-28d,P＜0.01);造模21 d和28 d时,SOD和GSH-Px的含量均显著性下降(AD-21d,P＜0.05;AD-28d,P＜0.01)。以上数据提示,肥大细胞通过促进AngⅡ产生,促进氧化应激,使GSH、SOD和GSH-Px的含量降低,从而加重肾损伤。

表3 各组大鼠血清GSH、SOD和GSH-Px的含量Table 3 The contents of GSH,SOD,and GSH-Px in sera of rats in each group

表4 各组大鼠肾脏GSH、SOD和GSH-Px的含量Table 4 The contents of GSH,SOD and GSH-Px in kidneys of rats in each group

3 讨论

肾脏作为尿酸主要的排泄器官,在维持尿酸水平相对稳定方面发挥着至关重要的作用。当血尿酸水平持续增高时,尿酸或尿酸盐在肾脏蓄积,引起肾小管上皮细胞功能紊乱、肾间质纤维化,以及肾小球滤过率下降[11]。本实验利用腺嘌呤-酵母粉联合喂养模拟高嘌呤饮食,诱导大鼠尿酸性肾损伤。结果显示,随着造模天数增加,模型组大鼠血清尿酸水平显著增加(表1),肾脏尿酸盐蓄积(图2),肾间质纤维化损伤加重(图3)。此外,随着造模天数增加,模型组大鼠血清肌酐、尿素氮及胱抑素C的水平也显著增加(表1)。上述结果表明,模拟高嘌呤饮食可造成大鼠尿酸性肾损伤。当肾功能下降或丧失时,机体代谢产生的氮质废物在体内蓄积并加重肾脏损害,这些物质也被称为尿毒素[12]。Duranton等[13]报道,硫酸吲哚酚和对甲酚硫酸盐等蛋白质结合型尿毒素极难经血液透析清除,其中经透析治疗后的患者体内硫酸吲哚酚的水平仍高达正常水平的20倍。尿毒素水平显著升高的现象往往在慢性肾损伤患者体内出现,而尿酸性肾损伤是导致慢性肾损伤的重要因素[14]。我们的研究结果显示,随着造模天数增加,大鼠肾脏结合型尿毒素(例如硫酸吲哚酚和对甲酚硫酸盐)水平显著上升,游离型尿毒素(例如N-乙酰-L-精氨酸和三甲胺-N-氧化物)水平也显著上升。其中,硫酸吲哚酚、马尿酸、N-乙酰-L-精氨酸、三甲胺-N-氧化物、N-肉桂酰甘氨酸和假尿苷的水平在造模14 d时就显著增加,而且随着造模天数增加,上述尿毒素水平逐渐增加;对甲酚葡糖苷酸水平仅在造模28 d时显著增加(图4)。上述结果说明,利用腺嘌呤-酵母粉联合喂养模拟高嘌呤饮食会导致肾脏尿酸盐排泄障碍和尿毒素水平显著升高。

Corry等[15]指出,尿酸通过激活单磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)通路,增加血管紧张素原的表达,促进AngⅡ的生成[6]。AngⅡ的增多能直接导致肾小管周围毛细血管的收缩或丢失,从而致使肾脏微血管系统受损[16～17]、肾小管间质性缺血缺氧以及肾间质纤维化[18],造成严重肾功能障碍。Li等[19]报道,在人肾脏疾病中,肾皮质、肾小管间质以及肾小球和血管周围区域的肥大细胞数量增加并活化。Veerappan等[17]发现,肥大细胞活化后可分泌多种介质,主要包括特定的蛋白酶(糜酶和胰酶)、组胺和炎性细胞因子。Yamada等[20]指出,靡酶是合成AngⅡ的重要活性酶,肥大细胞通过释放糜酶与人肾脏间质纤维化密切相关[21]。此外,Silver等[22]的研究发现,除了传统的肾素-血管紧张素系统外,肥大细胞也是肾素的来源途径,并且构成独特的肾素-血管紧张素系统,促进AngⅡ的产生。本研究发现,造模21 d和28 d的大鼠肾脏肥大细胞数量(图5)和血清AngⅡ含量(图6)均显著高于对照组,提示肥大细胞通过促进AngⅡ生成的途径参与尿酸性肾损伤。此外,与对照组相比,造模21 d和28 d时,大鼠血清GSH和GSH-Px的含量显著降低(表3),肾脏GSH、SOD和GSH-Px的含量显著降低(表4)。上述结果提示,肥大细胞通过促进AngⅡ的生成,引起肾小管周围毛细血管的收缩或丢失,进而导致肾脏缺血缺氧[16～17],加重肾脏氧化应激反应[23],使GSH、SOD和GSH-Px的含量降低。因此,阻断肥大细胞活化产生AngⅡ,抑制肾脏氧化应激反应,为治疗尿酸性肾损伤提供了一条新思路。

利益声明:本文全体作者均声明不存在利益冲突。