王淑娴，许 拉，樊 英，王友红，叶海斌，吴海一

(山东省海洋科学研究院 海洋食品与医药研究中心，山东 青岛 266104)

水蛭，别名马蛭、麻黄蜞、马蟥等，属于蛭纲，水蛭科动物，具有很高的药用价值。水蛭分布于世界各地，共有300多种，在我国有100余种。其中宽体金线蛭、茶色蛭及日本医蛭干燥的动物全体被《中华人民共和国药典》认定为中药药材[1]。水蛭在我国分布范围很广，在内陆淡水水域内生长繁殖，栖息于水田、沟渠中，吸食人、畜血液，是中国传统的特种药用水生动物。其干制品具有止痛、活血通经等功效，可用于治疗产后腹痛、高血压、中风偏瘫、肝损伤、肾病综合征等。另外活水蛭外用能吸血消肿，可用于治疗痈肿、丹毒等证。近年来由于农药、化肥等滥用，加之养殖户对水质综合调控的重视程度不够，致使水蛭生活环境逐渐恶化，各类病害频繁爆发，给水蛭养殖业造成了巨大损失。

2022年10月，山东某水蛭养殖场暴发病情，患病水蛭食欲不振，懒于活动，身体收缩，解剖可见内脏中有气泡。本研究从濒死的患病水蛭体内通过分离纯化获得一株优势菌株，并利用生理生化、分子生物学、Biolog微生物鉴定系统对该菌进行鉴定，旨在为生产中水蛭的疾病防治提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

TSA胰蛋白胨大豆琼脂培养基(购自青岛海博生物有限公司)用于细菌培养；生理生化鉴定管(购自杭州微生物试剂有限公司)用于细菌的生理生化分析；细菌快速鉴定板(购自美国Biolog公司)用于Biolog鉴定；细菌DNA提取和PCR试剂盒(Takara)用于模板提取及扩增，其他化学试剂和引物均购自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 优势菌株分离纯化 挑取患病的水蛭内脏组织，在TSA培养基上划线，28 ℃过夜培养，挑取优势菌落继续转接至纯培养，置于超低温冰箱(-80 ℃)中冻存备用。

1.2.2 菌落形态及理化特性检测 28 ℃下培养，观察菌落形态特征；将细菌进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察细菌形态；预先测定菌液浓度，将适量细菌接种于生理生化鉴定管中，过夜培养后观察结果。

1.2.3 Biolog分析 将供试菌株接入GenIII 第三代鉴定板，96孔板分布有阳性、阴性对照以及71种碳源、23化学敏感物质，培养24 h后通过Biolog微生物鉴定软件对测试板上的“表型指纹”进行分析。

1.2.4 16S rRNA基因序列分析和系统发育树的构建 利用广谱型基因组DNA小量提取试剂盒(TaKaRa)提取细菌DNA作为PCR反应模板。通用引物27F和1 492R作为16S rRNA 基因PCR扩增引物。50 μL PCR反应体系包含：DNA模板1 μL，引物( 10 μmol/L) 各2 μL，PremixTaqTM ( Ex TaqTM Version 2.0 plus dye) 25 μL，ddH2O 20 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；95 ℃变性1 min，55 ℃复性1 min，72 ℃延伸l min 30 s，30个循环；72 ℃温育10 min。吸取6 μL的PCR产物，经1.0%琼脂糖凝胶电泳20 min，利用凝胶成像仪观察。参考陆梦莹等[2]的方法，PCR产物送至上海生工生物有限公司测序，测序结果登陆GenBank进行BLAST比对，使用MEGA 4.0软件，采用邻接法构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 患病水蛭优势菌的分离纯化

从患病水蛭的病灶处，分离获得一株大小、形态、颜色一致的优势菌，命名为SZ-1，该菌在TSA 平板上生长菌落形态为圆形、砖红色、边缘不光滑。革兰氏染色镜检显示，该菌为革兰氏阴性菌，杆状，两端钝圆，有极生鞭毛。

2.2 菌株SZ-1生理生化特征及Biolog分析

菌株SZ-1在生理生化管中的生长情况显示：该菌能液化明胶，葡萄糖发酵、蔗糖发酵、乳糖发酵均为阳性；甲基红试验、柠檬酸盐发酵、接触酶反应均为阳性；乙醇、L-鼠李糖利用为阴性；水解淀粉、脂酶反应阴性。根据《伯杰氏系统细菌学手册( 第八版) 》[3]，各项指标经对比，与假单胞菌属相近。

通过Biolog GenIII第三代鉴定板检测发现，系统鉴定该菌株为荧光假单胞菌B(PseudomonasfluorescensB)，相似度(SIM )为0.541，位距(DIST)为4.439。测试板上的“表型指纹”分析结果如表1所示。

表1 菌株SZ-1 Biolog 鉴定板分析结果

2.3 16S rRNA基因序列分析与系统发育树构建

菌株SZ-1的16S rRNA 基因序列长度为1 443 bp，其序列通过NCBI-BLAST进行同源性检索显示其与荧光假单胞菌标准菌株MH304226.1的16S rRNA基因序列同源性最高，一致性达99.86%。从Genebank上选取典型的序列，包括荧光假单胞菌、温和气单胞菌(Aeromonassobria)、维氏气单胞菌(A.veronii)、类志贺邻单胞菌(Plesiomonasshigelloides)、鳗弧菌(Vibrioanguillarum)、灿烂弧菌(V.splendidus)、需钠弧菌(V.natriegens)、地中海弧菌(V.mediterranei)、欧式弧菌(V.owensii)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)的16S rRNA 基因序列，利用MEGA 4.0软件进行系统发育学分析，结果显示细菌SZ-1与荧光假单胞菌(MH304226.1和MG576170.1)聚合在一起(如图1所示)。

根据细菌SZ-1的生理生化特征、Biolog分析、16S rRNA基因序列分析以及系统发育树的构建，将细菌SZ-1鉴定为荧光假单胞菌。

注：分支上的数字表示这一分支的可靠程度；长度表示进化距离。

3 讨论

假单胞菌属(Pseudomonas)广泛分布于土壤、淡水、海水以及生物体中，是一类生长适应能力较强的革兰氏阴性菌，大多不致病，还有一部分是条件致病菌。在水产养殖业中，荧光假单胞菌是一类常见的水生生物条件致病菌，因感染荧光假单胞菌而引发各种细菌性疾病的情况越来越普遍，该菌能感染无脊椎动物和脊椎动物，对鱼虾的危害尤其严重[4-5]。徐国成等[6]发现荧光假单胞杆菌感染对虾后引起荧光病，虾苗出现活力下降，食欲不振，直至死亡。王高学等[7]发现大鲵感染该菌会患赤皮症，体表呈现出化脓性溃疡并且布满红斑块。中国常见的水产养殖鱼类中，荧光假单胞菌能够引起草鱼、鲤和大菱鲆等发生赤皮病[5]，但是目前还未有该菌引起水蛭患病的报道。

致病性荧光假单胞菌对水产动物的危害日益严重，且有研究表明它可能是一种潜在的人畜共患病原，能够引起菌血症、皮肤病、消化系统和呼吸道感染等疾病的爆发[8]，这警示人们应该对该菌引起重视。

本研究中通过细菌形态学特征、生理生化结果初步鉴定SZ-1菌株属于假单胞菌属。Biolog GenIII微孔板可对细菌进行71种碳源利用测试以及23 种化学敏感性测试，其“表型指纹”被用来在种水平上鉴定该微生物，本研究中Biolog GenIII分析鉴定该菌株为荧光假单胞菌。细菌SZ-1的16S rRNA 基因序列分析及系统发育树构建，显示该菌的16S rRNA基因序列与已报道的荧光假单胞菌(MH304226.1和MG576170.1) 16S rRNA基因序列的相似性高达99%以上，构建的系统发育树也表明，SZ-1菌株与荧光假单胞菌聚为一支。

综上所述，本研究中利用微生物学和分子生物学方法，对患病水蛭进行了病原菌的分离和鉴定，研究结果可为水蛭养殖过程中荧光假单胞菌的疾病防治提供基础资料。