刘金珂，何忠伟，刘玉峰，殷 蕊，孙桂清，宫春光

(1.河北农业大学 海洋学院，河北 秦皇岛 066000；2.河北省渤海鱼类种质资源保护与利用重点实验室，中国水产科学研究院 北戴河中心实验站，河北 秦皇岛 066100；3.河北省海洋与水产科学研究院，河北 秦皇岛 066200)

近年来已发现的具有降解亚硝酸盐能力的细菌包括芽孢杆菌属、副球菌属、假单胞菌属等[1-4]的一些种类。已发现的可降解亚硝酸盐的菌株往往存在性能不稳定、受环境理化条件影响大(特别是溶氧水平)以及可能造成硝酸盐累积等特点，多数并没有大规模在养殖生产上应用，仅在小试规模试验上偶有一些使用。本文通过筛选虹鳟养殖池底泥微生物分离得到一株托拉斯假单胞菌(Pseudomonastolaasii)，该菌株可以较好地减少水体中的亚硝酸盐氮含量，本试验为养殖生产减少亚硝酸盐氮对鱼虾的危害提供一种新的可选方案。

1 材料与方法

1.1 试验材料

培养基及配套试剂购自青岛海博生物技术有限公司。在河北邯郸某虹鳟养殖场养殖池均匀选取5个采样点，每点分别采集底泥后混合在一起，养殖水体温度为10 ℃。样品采集后以冰水浴保存立即转移至实验室进行后续分析。

1.2 试验方法

1.2.1 样品中微生物的分离纯化 用蒸馏水冲洗样品袋外表，再用70%乙醇擦拭后，在超净台中打开。用灭菌的药勺尽量均匀地从样品袋内5个点分别取一勺底泥，加入预先灭菌的液体三角瓶培养基中(LB培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、氯化钠 10 g/L，pH调至7.2)，在10 ℃摇床过夜培养。第二天从三角瓶中无菌吸取1 mL培养液，涂布至LB平板上，在10 ℃培养箱培养24 h。然后根据菌落特征分别挑取单菌落，每种菌落挑取一个，再涂布于LB平板，做纯化培养。纯化培养24 h后送上海迈浦生物科技有限公司进行16S rRNA测序。扩增区域为16Sr RNA基因的全长序列，扩增长度为1 500 bp。扩展使用引物为：27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；1 492R：GGTTACCTTGTTACGACTT。用DNA Sequencing analysis软件分析测序结果，用Sequencing Analysis 5.2.0软件进行解读，结果进入http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi进行比对。使用MEGA11的Neighbor Joining方法构建系统进化树。

1.2.2 生长特性 对得到的菌株进行摇瓶试验，确定其基本的营养需求和生长所需的理化条件。以亚硝酸钠为唯一氮源，葡萄糖、蔗糖、麦芽糖分别作为碳源，pH值设6、7、8三个梯度，温度设8、10、12 ℃三个梯度，转速设150、180、210 r/min三个梯度，采用正交试验方法，以培养48 h的有效活菌数作为判定指标。

1.2.3 减氮能力检验 以亚硝酸钠为唯一氮源，亚硝酸钠初始含量为200 mg/L，在500 mL摇瓶中装入100 mL培养液，分别在第18、24、30、36、42 小时和48 小时测定亚硝酸氮和总氮含量，使用以下公式计算对氮的去除效率：

亚硝酸盐氮去除效率(%)= 100×(初始亚硝酸盐氮含量-终末亚硝酸盐氮含量)/初始亚硝酸盐氮含量；

总氮去除效率(%)= 100×(总氮含量-终末总氮含量)/初始总氮含量。

总氮用碱性过硫酸钾消解法测定，亚硝酸盐氮用N-(1-萘基)-乙二胺光度法测定，分别做三个重复。

2 结果

2.1 菌种分离及鉴定结果

从样品中共分离到12株菌，其中一株经16S rRNA测序并与NCBI核酸数据库比对后，构建进化树，结果显示其与托拉斯假单胞菌MW326021(Pseudomonastolaasii)和浅黄色假单胞菌MH669334(Pseudomonaslurida)最相似(图1)，相似度分别为99.58%和99.51%。根据样品中菌株分离顺序将本株菌编号为G86。显微镜下G86为杆菌，革兰氏阴性，不生成芽孢。在LB平板上菌落粗糙，土黄色，边缘不整齐，不产色素。生理生化试验显示，G86能利用内消旋肌醇、L-缬氨酸、β-丙氨酸、山梨醇、中性酒石酸盐、盐酸，部分利用海藻糖、2-酮基葡萄糖酸、L-阿拉伯糖、核糖醇和乙醇，过氧化酶和氧化酶阳性(表1)。根据生理生化鉴定结果，查阅伯杰氏系统细菌学手册[5]，菌株G86和托拉斯假单胞菌高度相似，结合16S rRNA比对结果，确定G86为托拉斯假单胞菌。

表1 G86生理生化鉴定结果

图1 G86的系统进化树(MEGA11)

2.2 生长特性

根据3水平4因素正交试验结果(表2)，确定G86的最适生长条件为：pH值 6，温度10 ℃，转速180 r/min，此条件下有效活菌数可达到9.2×108CFU/mL。

表2 托拉斯假单胞菌G86的正交试验设计表

2.3 减氮能力

以上述最优条件摇瓶培养G86，测得不同时间培养液中亚硝酸盐氮和总氮去除率，变化曲线见图2。结果显示，以亚硝酸钠为唯一氮源，72 h对总氮和亚硝酸盐氮的去除率分别为33.05%和31.85%。

图2 接种G86后总氮和亚硝酸盐氮的去除能力

3 分析与讨论

水体中氨氮和亚硝酸盐氮过高是造成水产养殖动物体质下降的重要原因之一，科研工作者一直在寻找高效、安全的解决方案。近年来已有很多学者对硝化和反硝化细菌进行了研究。王珺等[6]从污水底泥筛选到浅黄色假单胞菌，具氨氮降解率可达到96.4%。而浅黄色假单胞菌和托拉斯假单胞菌的16S rRNA序列相似度超过99%，表明此属细菌中可能含有具反硝化能力的基因或基因群，今后可加大对此属菌株降解氨氮能力的识别和开发。何腾霞等[7]从土壤中分离到一株托拉斯假单胞菌，48 h对亚硝酸盐氮和总氮的去除率分别为100%和61.28%。新发现的具有降解氨氮能力的菌株很多营好氧生活，这对于在养殖生产上的扩培是有利的，但是从与养殖对象竞争氧气的角度来讲，这又是不利的一面。而周敏等[8]从污水混合样品中分离到的大山芽孢杆菌，可在3 h将水体中的亚硝酸盐从0.6 mg/L降低到0.0 mg/L。以上研究说明在自然界中存在着较多的能够降低总氮和亚硝酸盐氮浓度的菌株，这些菌株多具有开发成降解亚硝酸盐的微生态制剂产品的价值。

4 结论

通过显微形态、16S rRNA基因序列比对，本试验分离的菌株G86为托拉斯假单胞菌(Pseudomonastolaasii)。该菌株的最适生长条件为：温度10 ℃、pH值 6、转速180 r/min，在48 h对总氮和亚硝酸盐氮的去除率分别为33.05%和31.85%。该菌株具有在有氧条件下去除亚硝酸盐氮的能力，可以作为养殖生产上降解亚硝酸盐的备选菌株，具有一定开发潜力。本研究中，菌株G86对氮的去除率低于其他文献报道，可能是本次试验没有找到最适的接种量、接种时间和培养条件，下一步研究将更多考虑可能影响托拉斯假单胞菌株G86去除亚硝酸盐氮的环境因素，以期找到适用于养殖生产的最优使用方案。