苗俊峰，翁嘉劲，霍莹莹，郭炜

（山西大学 化学化工学院，山西 太原 030006）

0 引言

光动力治疗（PDT）是利用光敏剂和光活化治疗肿瘤的一种新方法［1-3］，用特定波长的光照射肿瘤部位，可以使聚集在肿瘤组织中的光敏剂活化，引发光化学反应，从而破坏肿瘤。目前，传统治疗肿瘤的方法有手术治疗，化疗以及放疗。PDT与之相比具有诸多优点，如暗毒性低，时空分辨率高，无耐药性，可重复治疗等。因此，PDT试剂的设计与开发引起了广大研究者的兴趣。如图1所示，PDT一般有两种作用机制，即 I型和 II型［4-5］，其基本原理是：光敏剂受到特定波长的光激发跃迁到激发单重态（S1），通过系间窜跃至激发三重态（T1），T1态的光敏剂将电子转移至周围的分子或氧气形成高活性的自由基或超氧阴离子（O2·-），从而杀死肿瘤细胞，即为I型。T1态的光敏剂通过碰撞直接将能量传递给周围的氧气形成单线态氧（1O2），从而杀死肿瘤细胞，即为II型［6］。

图1 PDT机制Fig.1 Reaction mechanisms of PDT

光动力治疗的核心是光敏药物，它的功能和效率决定了治疗效果。经过多年的发展，肿瘤的光动力治疗取得了巨大的进步，已在临床肿瘤治疗中展现出独特的优势［7-11］，如广泛应用的血卟啉前体光敏剂（ALA），其在体内可自发生成光敏剂Protoprpdyrin IX，从而实现上皮，口腔等癌症的有效光动力治疗，然而传统的卟啉类光敏剂在近红外区的摩尔吸光系数较小，单线态氧量子产率较低，并且在人体内代谢缓慢［12-17］。因此，开发新型的PDT试剂是该领域的重点。目前，光敏剂的开发最广泛的方法是将Br、I等重原子引入荧光团，利用重原子效应增强电子的自旋轨道耦合，从而提高系间窜跃的效率以及单线态氧的量子收率［18-23］。目前报道的高单线态氧量子产率的PDT试剂较少［24-25］，但由于肿瘤环境中氧气含量较低，只有高单线态氧量子产率的光敏剂才能达到对肿瘤良好的治疗效果［26-28］。因此，本论文的研究工作旨在开发高单线态氧量子产率的PDT试剂。

为了开发出优异的PDT试剂，本论文以2-羟苯基-苯并噻唑为染料平台，将重原子I引入其骨架，利用重原子效应开发出新型的光动力试剂HBT-I（如图2所示），HBT-I的单线态氧量子产率高达0.86，由于肿瘤的低氧环境，我们在正常氧以及低氧条件下进行了抑制细胞增殖实验，测得半抑制浓度（IC50）分别为0.38 μmol和 0.40 μmol，表明该光动力试剂治疗时对氧浓度依赖较低，在低氧浓度下依然治疗效果良好，有望成为优异的光动力治疗肿瘤的工具。

图2 HBT-I的分子结构Fig.2 Structure of HBT-1

1 实验部分

1.1 实验仪器与试剂

荧光光谱仪Hitachi F-7000；紫外可见光谱仪Varian Cary 4000；高分辨质谱仪Varian QFTESI；超导核磁共振仪Bruker ARX600；激光共聚焦显微镜Zeiss LSM 880。合成过程所用的试剂均为分析纯，测试过程所用试剂均为色谱纯，所用水均为二次蒸馏水。

1.2 探针的合成

光敏剂HBT-I的合成路线见式1。

式1 HBT-I的合成步骤Scheme 1 Synthesis of HBT-I

3，5-二碘邻羟基苯甲醛（10 mmol）和2-氨基苯硫酚（10 mmol）在15 mL乙醇中回流3 h，将产生的红色沉淀过滤并洗涤，之后将其溶解在50 mL CH2Cl2中分批次加入2，6-二氯-3，5-二氰基-1，4-苯醌（DDQ）（12 mmol），在室温下搅拌过夜。减压蒸馏除去溶剂，粗产品用二氧化硅柱色谱进行纯化（CH2Cl2∶石油醚=2∶8），得到化合物HBT-I，产物为黄色粉末（80%）。1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ 13.72（s，1H），8.12（d，J=0.7 Hz，1H），7.98（d，J=8.1 Hz，1H），7.94（d，J=8.5 Hz，2H），7.56（t，J=7.5 Hz，1H），7.48（t，J=7.5 Hz，1H）。13C NMR（151 MHz，CDCl3）δ 166.64，156.70， 150.98， 148.84， 136.51， 132.77，127.19， 126.31， 122.44， 121.75， 118.41，80.67.ESI-MS：Calcd for［M+H］+478.833 8，Found 478.833 8。

1.3 吸收光谱与荧光光谱的测定

光敏剂HBT-I溶解到二甲亚砜溶剂中配制成2 mmol的储备液，Varian Cary 4000紫外-可见分光光度计所测得的光谱为HBT-I溶液的紫外可见吸收光谱，Hitachi F-7000荧光光谱仪测试溶液的荧光光发射谱。测试过程中，为取得最佳信噪比，仪器狭缝已调节至适宜宽度。

1.4 单线态氧量子产率测试

参比光敏剂我们选用三（2，2'-联吡啶）二氯化钌（Ru（bipy）3Cl2），单线态氧量子产率（ΦΔ）经检测 1，3-二苯基异苯并呋喃（DPBF）在415 nm处的吸收变化进行计算得出。首先，加入适当浓度的Ru（bipy）3Cl2或者待测溶剂于3 mL各溶剂中，调节溶液415 nm处的吸光度值接近0.1。然后，加入适当浓度新配制的DPBF溶液使其混合液在415 nm处吸光度处于1.1至1.2之间。随后，将此混合物溶液于450 nm的LED光源照射下，每5 s进行一次测量，并用UV-vis分光光度计记录溶液的紫外可见吸收光谱。最后通过公式（1）来计算待测染料的单线态氧量子产率：

其中ΦΔ代表待测染料的单线态氧量子产率，Φ0代表参比三（2，2'-联吡啶）二氯化钌的单线态氧量子产率（Φ0=0.73，甲醇）。下标PS代表待测光敏剂，k代表DPBF在415 nm处的吸光度随光照时间增加而降低的斜率。F为校正因子，通过公式（2）计算：

其中OD表示溶液在450 nm处的吸光度值。

1.5 MTT实验

A549细胞置于37℃、5%CO2培养箱中在DMEM培养基中培养。将A549细胞以每孔5000个细胞的密度接种在96孔细胞培养板中。细胞附着24 h后，用PBS清洗平板，然后加入含有不同浓度的HBT-I的DMEM培养基。培养30 min后，用PBS洗涤培养板，然后每孔加入 100 μL DMEM，用 450 nm LED 灯照射（20 mW·cm-2，5 min）。光照后，让细胞继续生长24 h，然后向每个孔中加入含有10 μL MTT（5 mg/mL）的PBS中溶液。将细胞再培养4 h后，取出培养基，向每个孔中添加DMSO（100 μL），并在室温下轻轻摇晃10 min。为了评估暗毒性，96孔板未进行光照，所有其他步骤均相同。

1.6 激光共聚焦实验

实验采用玻璃底细胞培养皿（35 mm）上，细胞贴壁12 h。实验前，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞3次。使用商业化的SOSG作为检测细胞中1O2的指示剂，在有1O2存在的情况下可以发射绿色荧光。A549细胞在共聚焦培养皿上贴壁后，加入1 mL含有 1 μmol HBT-I的DMEM培养基中培养30 min，然后用2 μmol SOSG再培养30 min。用PBS冲洗3次后，用450 nm LED灯照射（20 mW·cm-2，5 min），然后在CLSM下成像，观察细胞内1O2水平。对于1O2猝灭实验，A549细胞预先用50 μmol NaN3培养 2 h，然后分别依次用HBT-I和SOSG培养。450 nm LED灯照射（20 mW·cm-2，5 min）后，在CLSM下进行荧光成像。SOSG收集波长为 493 nm～600 nm（λex=488 nm）。

用钙黄绿素（Calcein AM）/碘化丙啶（PI）分别作为活细胞和死细胞的染色剂来研究HBT-I介导的光诱导细胞凋亡。A549细胞在含 有 HBT-I（1 μmol）的 DMEM 中 培 养 30 min。用PBS洗涤3次后，用450 nm LED灯照射（20 mW·cm-2，5 min）。6 h后，细胞用Calcein AM（2 μmol）/PI（1 μmol）培 养 30 min，用PBS冲洗3次后，在CLSM下进行荧光成像。PI的收集波长为600 nm到700 nm收集发射（λex=488 nm）；Calcein AM的收集波长为493 nm到550 nm发射（λex=488 nm）。

2 结果与讨论

2.1 光敏剂HBT--I在不同溶剂下的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱

为测试光敏剂HBT-I的紫外可见吸收光谱和荧光发射光谱，我们在乙腈，二氯甲烷，甲苯和甲醇中分别加入2 μmol的HBT-I溶液，结果如图3所示，乙腈中最大吸收波长分别在359 nm和423 nm，最大发射波长为 474 nm；二氯甲烷中最大吸收峰为355 nm，最大发射波长为433 nm；甲苯中最大吸收峰为358 nm，最大发射波长为437 nm；甲醇中最大吸收峰为358 nm，最大发射波长为437 nm。在乙腈与甲醇中可分别观察到423 nm与401 nm处的吸收，这是由于HBT-I部分烯醇式结构转换为了酮式结构（图3所示），发生了红移。HBT-I在甲苯中有两个明显的最高发射峰440 nm和560 nm，440 nm处的发射峰为其正常的荧光峰，560 nm处的发射峰是由于HBT-I被激发后发生了激发态质子转移形成酮式结构后的发射峰。

图3 HBT-I在不同溶剂中紫外可见吸收光谱和荧光发射光谱。（a）紫外可见吸收光谱；（b）荧光发射光谱Fig.3 Spectra in different solvents of HBT-I.（a）Absorption visible absorption spectrum；（b）Fluorescence emission spectrum

2.2 光敏剂HBT--I产生单线态氧产率的测定

为了探究HBT-I在体外的单线态氧产生能力，用1，3-二苯异苯并呋喃（DPBF）作为单线态氧捕获剂，三（2，2'-联吡啶）二氯化钌（Ru（bipy）3Cl2）作为参比，测定了化合物 HBT-I的单线态氧量子产率。结果如图4所示。在450 nm光源照射下，含有HBT-I的DPBF溶液在415 nm处的吸光度快速下降，说明HBT-I在光照射下可以产生单线态氧导致DPBF被漂白。我们测试了在溶剂（A）乙腈，（B）二氯甲烷，（C）甲苯和（D）甲醇中单线态氧的量子产率。通过计算，HBT-I在四种溶剂中的单线态氧量子 产 率 分 别 为 0.86，0.77，0.80，0.45。 说 明HBT引入碘原子后，系间窜越效率极高，因而单线态氧产生的能力增强。

图4 450 nm光照下DPBF在各种溶剂下的光漂白曲线。（a）乙腈，（b）二氯甲烷，（c）甲苯和（d）甲醇；（e）参比光敏剂在450 nm光照下的光漂白曲线；（f）A-D溶液415 nm处吸光度对数值随光照时间的线性拟合Fig.4 Photobleaching curves of DPBF in various solvents under 450 nm light.（a）Acetonitrile，（b）Dichloromethane，（c）Toluene and（d）Methanol；（e）Photobleaching curve of reference photosensitizer under 450 nm light；（f）Linear fitting of absorbance logarithm value ofA-D solution at 415 nm with illumination time

2.3 光敏剂HBT--I在细胞中的MTT实验

利用MTT法我们评估了HBT-I对人肺癌A549细胞的PDT疗效。细胞给药后，将HBTI负载的细胞在37℃下进一步培养24 h后加入MTT试剂。如图5所示，光敏剂HBT-I在1～10 μmol/L浓度范围内均表现出极低的暗毒性，表明它具有良好的生物相容性。然而，当用450 nm的 LED光照后（20 mW·cm-2，5 min），随着HBT-I浓度的增加，能够有效抑制细胞增殖（例如，在浓度为4 μmol，对细胞增殖的抑制率能达到96%），在常氧（20% O2）和低氧（1% O2）的条件下 IC50值分别低至 0.38 μmol和 0.4 μmol。这些结果表明，HBT-I的高单线态氧产率使其在肿瘤细胞中具有良好的PDT效果。

图5 HBT-I在A549细胞中的MTT实验。（a）20% O2暗毒性，（b）20% O2光毒性，（c）1% O2光毒性Fig.5 MTT assay of HBT-I in A549 cells.（a）20% O2Lighted（-），（b）20% O2Lighted（+），（c）1% O2Lighted（+）

2.4 光敏剂HBT--I在细胞中的共聚焦成像实验

为了验证细胞死亡机制，我们评估了HBT-I在A549细胞中经光照后生成1O2的能力。使用商业化的SOSG作为检测细胞中1O2的荧光探针，经LED光（20 mW·cm-2，5 min）照射后，绿通道可以观察到强的荧光产生，表明HBT-I在细胞内发生PDT过程并产生大量1O2；此外，如果 预 先 用1O2的 清 除 剂 NaN3（50 μmol，120 分钟）孵育A549细胞，则绿通道内几乎没有荧光。表明HBT-I在细胞中光毒性主要由1O2引起。

为了进一步证明HBT-I对细胞的光毒性，我们用钙黄绿素（Calcein AM）/碘化丙啶（PI）分别作为活细胞和死细胞的染色剂，来验证其PDT过程杀死细胞的能力。如图7所示，450 nm LED光（20 mW·cm-2）连续照射5 min后再孵育2 h，几乎所有负载HBT-I的A549细胞在PI通道显示强的荧光，而Calcein AM通道的荧光基本完全消失，表明细胞完全死亡。此外，负载HBT-I的A549细胞的形态发生了明显变化，显示出典型的细胞晚期凋亡迹象，而未经处理的对照细胞在LED光照射后未表现出此类变化。

图7 光照和非光照条件下活细胞和死细胞的染色Fig.7 Staining of living and dead cells under light irradiation and no light irradiation

细胞共聚焦实验证实了HBT-I负载的细胞在光照条件下可以产生1O2，并具有明显的细胞毒性，能够导致细胞死亡。

3 结论

本论文利用重原子效应提高系间窜跃效率的策略，设计合成出HBT-I。经过测试，HBT-I具有高的单线态氧量子收率，其值达到0.86，满足了肿瘤低氧环境下实现良好光动力治疗的条件。另外在正常氧含量以及低氧条件下进行了抑制细胞增殖实验，测得半抑制浓度分别为0.38 μmol和 0.40 μmol，表明 HBT-I治疗时对氧含量依赖较低，并且在低氧浓度下表现出较好的治疗效果，细胞共聚焦实验也验证HBT-I的治疗机制以及良好的治疗效果，以上结果表明HBT-I有望成为性能优异的光动力治疗肿瘤试剂。

图6 HBT-I在A549细胞中生成1O2Fig 6 HBT-I generates1O2in A549 cells