郭丽苹，苏 娟（通信作者），胡亚荣，陈名阳

（大理大学基础医学院 云南 大理 671000）

肝缺血-再灌注损伤（hepatic ischemia-reperfusion injury, HIRI）是指肝脏因手术或意外缺血一段时间，之后再恢复血供时，肝脏损伤进一步加重的现象。HIRI 多发生在创伤性休克、阻断血管的肝脏切除术和肝移植过程中，常可导致术后并发症的发生，直接影响患者的预后。临床上对HIRI 的治疗有外科手术和药物治疗[1]。手术治疗包括缺血预适应、缺血后适应、机器灌注。因缺血大多情况下为不可预知因素，且缺血后适应的每一次再灌注都可能导致出血，限制了缺血预适应和后适应在临床中的应用；机器灌注因技术复杂性限制了其在临床上的应用。药物治疗方面，常用的是抗炎、抗氧化类药物，但多因肝脏毒性不良反应和靶点的单一性，降低了其对HIRI 的治疗效果[2]。中药在多种疾病治疗的过程中体现了良好的效果及较小的不良反应。研究表明灯盏细辛有抗炎、抗凋亡和调节氧化应激等作用[1,3]。关于灯盏细辛在脑、心肌和肾缺血再灌注损伤中的研究较多，但鲜有HIRI 相关研究。因此本研究拟采用网络药理学预测灯盏细辛治疗HIRI 的潜在机制，同时利用分子对接技术对潜在靶点进行初步验证，以期为后续实验研究及临床应用提供依据。

1.资料与方法

1.1 药物活性成分的鉴定和作用靶点的筛选

在一定条件的口服生物利用度（OB）和类药性（DL）下，利用中药系统药理学数据库与分析平台筛选灯盏细辛活性成分，并整理活性成分相对应的靶点信息，再采用Uniprot 数据库将靶点信息标准化。

1.2 药物对抗疾病的靶点预测

以“hepatic ischemia-reperfusion injury”为关键词，在GeneCards 数据库中获得HIRI 疾病靶点。将1.1中的药物靶点和HIRI 疾病靶点导入Venny2.1.0 在线软件作图工具平台进行交集，得到药物与疾病的交叉靶点。采用Cytoscape3.7.1 软件将以上药物、成分及疾病、靶点进行可视化。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建与分析

将1.2 中得到的交叉靶点采用STRING 数据库进行分析并构建PPI 网络。然后利用Cytoscape3.7.1 软件中的cytoHubba 插件对网络进行统计分析，获得排名前10 的关键靶点。

1.4 通路富集分析

采用DAVID 数据库，设置P≤0.05，将1.2 中获得的交叉靶点进行GO 和KEGG 富集分析。采用微生信在线工具将筛选整理后的数据进行可视化分析，进一步说明靶点和信号通路在灯盏细辛治疗HIRI 的作用。

1.5 分子对接

通过GO 和KEGG 富集分析，确定灯盏细辛活性成分靶向HIRI 的潜在核心靶蛋白。分别利用RSCB PDB数据库和中药系统药理学数据库与分析平台，获得核心靶蛋白及活性成分的3D 结构。将两者的3D 结构导入AutoDock Tools 软件进行脱水、加氢处理后，采用AutoDock Vina 插件进行分子对接。最后利用Pymol 软件实现数据可视化及均方根差值的计算。当均方根差值≤2.0 时，证明分子对接是成功的。

2.结果

2.1 灯盏细辛潜在活性成分的鉴定和作用靶点的筛选

在中药系统药理学数据库与分析平台中输入灯盏细辛、设置OB ≥30%、DL ≥0.18，筛选出12 个潜在活性成分（见表1）和相对应的靶点。利用UniProt 数据库对靶点进行标准化，将标准化的信息进行整理后，获得203 个药物靶点。

表1 灯盏细辛潜在活性成分

2.2 药物对抗疾病的靶点预测

通过GeneCards 数据库获得1 188 个疾病靶点。将1 188 个疾病靶点和2.1 中药物的203 个靶点在Venny2.1.0 在线软件作图工具平台上进行分析，并绘制韦恩图（见图1）。共获得111 个交叉靶点，即药物对抗疾病的潜在靶点。

图1 灯盏西细辛与HIRI 靶点韦恩图

2.3 网络模型的构建与分析

将2.2 中获得的111 个交叉靶点与2.1 中获得的12 个活性成分对应的203 个靶点进行比对，并删除不含交集靶点所对应的活性成分，最终获得9 个潜在活性成分。利用Cytoscape3.7.1 软件绘制“药物-成分-靶点-疾病”网络图（见图2），并分析出9 种活性成分的度值（见表2），度值越大提示该活性成分越重要。

表2 灯盏细辛9 种活性成分的度值

图2 药物-成分-靶点-疾病的相互作用网络

红色三角形表示药物，蓝色菱形表示活性成分，绿色椭圆形表示共同靶点，黄色长方形表示疾病。

2.4 PPI 网络构建与分析

将111 个交叉靶点导入STRING 数据库中，选择物种为人，设置置信度≥0.4，构建PPI 网络图（见图3）。利用Cytoscape3.7.1 软件对PPI 结果进行分析，得到度值较大的前10 名基因TNF、AKT1、IL6、IL1B、VEGFA、TP53、PTGS2、CASP3、MMP9、HIF1A 可能是灯盏细辛治疗HIRI 的潜在靶点。

图3 灯盏细辛与HIRI 的111 个交叉靶点的PPI 图

2.5 富集分析

采用DAVID 数据库对交集靶点进行富集分析。GO 结果显示，富集到645 条生物过程（BP），主要与基因表达的正调控、凋亡过程、炎症反应、信号转导等生物反馈调节过程相关；富集到56 条细胞组分（CC），主要有胞质溶胶、细胞质、核、线粒体等；富集到111个分子功能（MF），主要与蛋白质结合、转录激活因子活性、DNA 结合等有关。选择BP、CC、MF 富集程度的前20 的结果用微生信在线软件进行柱状图绘制（见图4）。KEGG 结果显示，共富集到158 条信号通路，包括PI3K-Akt、细胞凋亡、癌症、脂质与动脉粥样硬化等信号通路。将排名前20 的GO 和KEGG结果用微生信在线软件绘制成气泡图（见图5）。

图4 灯盏细辛治疗HIRI 的GO 富集分析

图5 灯盏细辛治疗HIRI 的KEGG 富集分析

2.6 分子对接

运用AutoDock Vina 1.1.2 将灯盏细辛活性成分中度值＞50 的槲皮素、山柰酚、木犀草素分别对接至TNF、AKT1、IL6、IL1B、VEGFA、TP53、PTGS2、CASP3、MMP9、HIF1A 的活性口袋，并获得Vina 得分（见图6）。Vina 得分越低代表靶蛋白和药物小分子的亲和力越高。利用PyMOL 软件计算所得均方根差值均小于1，提示槲皮素、山柰酚、木犀草素与TNF、AKT1、IL6、IL1B、VEGFA、TP53、PTGS2、CASP3、MMP9、HIF1A 均有较好的结合能力。

图6 灯盏细辛主要活性成分与PPI 网络排名前10 靶蛋白的结合能热图

3.讨论

HIRI 是肝脏手术不可避免的并发症，直接影响患者的预后。HIRI 的发生机制尚未明确，目前认为主要的发生机制有自由基生成增多、细胞内钙超载和炎症反应过度激活等。因HIRI 病理过程复杂性，限制了目前相关治疗的效果。灯盏细辛是临床上治疗心、脑组织缺血性卒中的常用药。目前尚无临床上灯盏细辛治疗HIRI 的数据。有研究表明[4]灯盏细辛注射液能提高SD 大鼠肝脏组织中SOD 及Bcl-2 的表达，降低MDA 及Bax 的表达，对HIRI 起保护作用，但具体机制尚不明确。

因此，本研究在网络药理学和分子对接的基础上，初步探索灯盏细辛治疗HIRI 的机制，为HIRI 的预防、治疗提供研究方向。网络药理学结果表明，灯盏细辛有9 个活性成分通过111 个靶点对抗HIRI，其中最重要的活性成分有木犀草素、槲皮素、山柰酚。有研究表明槲皮素对HIRI 具有保护作用[5]。木犀草素对脑、心脏和肾组织缺血再灌注损伤有保护作用，主要机制涉及氧化应激、炎症反应、细胞凋亡等[6-8]，目前对于HIRI 的作用还需要进一步研究。灯盏细辛与HIRI 的交集靶点PPI 网络分析结果显示，核心靶点前10 位分别为TNF、AKT1、IL6、IL1B、VEGFA、TP53、PTGS2、CASP3、MMP9、HIF1A。IL6 是体内重要的炎性介质，主要来源于肝脏。TNF-α 能够通过激活NF-κB 诱导IL6 的表达[9]。TNF-α 是TNF 的亚型，在肝脏缺血、缺氧时由激活的巨噬细胞释放，TNF-α 可以趋化和激活中性粒细胞和白细胞[10]，加重肝细胞的损伤与坏死。GO 和KEGG 富集分析结果提示，灯盏细辛活性成分能够调节基因表达、信号转导及凋亡和炎症过程等，并通过AGE-RAGE 信号通路、PI3K-Akt 信号通路、TNF 信号通路等对HIRI 起治疗作用。RAGE（晚期糖基化终末产物受体）在肝脏中广泛表达[11]，可激活促炎因子进一步介导肝组织的损伤[12]。多种因素可通过PI3K-Akt 信号通路保护HIRI[13-14]。

综上所述，灯盏细辛可通过多靶点、多通路对HIRI起到保护作用。目前通过网络药理学和分子对接所得的结果为后续进一步实验研究指引了方向。