游六勇，罗文英

（广东医科大学附属医院检验科，广东 湛江 524000）

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是临床上常见的革兰阴性杆菌，也是医院慢性感染的主要原因之一[1]。细菌生物膜是一种主要由细菌自生的胞外多聚物所构筑的膜样结构，其作为支架将细菌包裹在生物或者非生物表面，保护细菌免受外部环境压力、阻碍免疫细胞吞噬，赋予细菌长期定植和抗生素耐药的能力[2，3]。近年来生物膜相关的慢性感染如囊性肺纤维化、伤口感染、牙周疾病等发病率显著增加，严重影响患者的生活质量。有研究表明[4-6]，生物膜与某些癌症的发生密切相关，如乳腺植入物相关的淋巴瘤、头颈部相关肿瘤、腺瘤性息肉病的早发性息肉形成等。由于生物膜的复杂性和特殊性，生物膜相关感染通常在长期临床静止后反复，单一的抗生素治疗往往难以有效杀灭生物膜相关感染的病原菌，给临床控制生物膜相关感染带来了极大的挑战。本文就铜绿假单胞菌生物膜干预治疗研究作一综述。

1 生物膜的一般特征

生物膜是包裹在菌体外由胞外多糖，基质蛋白和e-DNA组成的聚集体，其形成过程通常有几个阶段，即微生物细胞对表面的初始附着、附着细胞的聚集、生物膜的生长成熟以及生物膜分散[7，8]。粘附素，Ⅳ型菌毛，Psl 和脂多糖参与铜绿假单胞菌的初始附着过程，并受c-di-GMP 和小调节RNA（sRNA）调节。生物膜成熟的特征是生物膜结构的形成和细胞外基质的产生，此过程主要受QS 调控[9]。生物膜分散阶段包括剥落、侵蚀和扩散，其中剥落和侵蚀是被动脱离，而扩散是主动脱离[10]。研究表明[11]，不含活菌的生物膜也有一定促进其他微生物定植的潜力，说明杀灭细菌可能对于治疗生物膜相关感染远远不够，消除生物膜也是抗菌治疗中的关键问题。

2 生物膜的干预治疗

2.1 抗生素 抗生素的主要作用是杀灭微生物，达到治疗感染的目的。但对于铜绿假单胞菌来说，临床常用的抗生素往往难以穿透生物膜作用于细菌菌体，导致临床治疗效果差，感染控制不佳，患者病情迁延不愈。但也有研究表明某些抗生素具有抑制或消除生物膜的作用，如牛瑜等[12]研究表明，亚抑菌浓度（1/16 MIC、1/4 MIC）的阿奇霉素以及克拉霉素均可显著降低铜绿假单胞菌在医用微孔滤膜模型上的生物膜黏附。Bala A 等[13]研究表明，阿奇霉素能影响铜绿假单胞菌的膜通透性，进而影响相关信号分子3-oxo-C12-HSL 等的穿透，最终导致生物膜形成及黏附受到抑制。Gupta P 等[14]研究表明，亚抑菌浓度的环丙沙星虽然不能抑制铜绿假单胞菌的生长，但是能通过抑制弹性蛋白酶及毒力因子的产生，从而抑制生物膜的形成。目前亚抑菌浓度抗生素对铜绿假单胞菌生物膜的影响作用研究多停留于短期体外研究，而对于长期暴露亚抑菌浓度抗生素的实验及相关机制研究较少，因此其相关研究方向值得讨论。

2.2 抗生素的联合使用 铜绿假单胞菌生物膜的形成是其耐药的主要机制，生物膜作为一层物理屏障，可有效延缓或阻止大部分临床抗菌药物的渗入。某些抗生素能通过抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成或分解已经成熟铜绿假单胞菌生物膜，为难以渗透铜绿假单胞菌生物膜的抗生素提供条件，也为抗生素的联合使用提供基础。对于铜绿假单胞菌来说，抗生素的联合使用不仅能减少单一抗生素的使用剂量，还能大大提高对铜绿假单胞菌的杀灭能力。Gloria H 等[15]研究表明，与单一抗生素相比，妥布霉素与多粘菌素的联合使用可显著减少铜绿假单胞菌生物膜模型细菌的数量，降低大鼠肺部感染模型的细菌数量及死亡率，改善肺部感染模型的病理情况。张艳芳等[16]研究发现，大环内酯类药物联合阿米卡星可能通过抑制致病因子藻酸盐、蛋白水解酶和绿脓菌素的分泌，显著降低临床分离的铜绿假单胞菌生物膜的形成。临床在治疗铜绿假单胞菌引起的生物膜相关感染时应综合考虑药效和个体化情况，合适的抗生素组合可能是未来研究的重点。

2.3 药物新用途 由于研发新型抗生素周期长、花费大，很多研究者积极开发已有药物的新型用途，并发现了一些抗生物膜的潜在药物，因此开发现有药物的新型用途也成为了的热门研究方向[17]。阿司匹林作为一种非甾体类解热镇痛消炎药被广泛应用于心血管及风湿免疫性疾病，其具有广谱抗菌活性。王央霞等[18]研究发现，5 mg/ml 阿司匹林剂量便可抑制铜绿假单胞菌的生长。此外，阿司匹林不仅能显著抑制生物膜的形成，还能促使24 h 生物膜的分解，使铜绿假单胞菌的初始黏附功能降低50%左右。乙酰半胱氨酸作为黏液溶解剂，可通过断裂痰液中糖蛋白多肽链，产生较强的黏痰溶解作用。赵铁梅等[19，20]研究发现，乙酰半胱氨酸能减少生物膜中基质样物质的形成，小剂量乙酰半胱氨酸还能增强左氧氟沙星对生物膜内铜绿假单胞菌的杀菌活性，在大鼠气道铜绿假单胞菌生物膜感染模型中，雾化吸入乙酰半胱氨酸与生理盐水组对比，前者导管被覆的不定型物质明显变薄，小剂量乙酰半胱氨酸还能增强环丙沙星在大鼠气道铜绿假单胞菌生物膜感染模型中的治疗效果。临床上常见的化痰药巯乙磺酸钠与氨溴索也可抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成，协同增强常见抗生素的治疗效果[21，22]。虽然药物的新用途可能是缓解新药开发压力的途径，但大部分被研究的抗生物膜活性实验仅在体外条件下试验，对其体内的抗生物膜疗效需要进一步的实验验证，临床应用尚待商榷。

2.4 抗菌肽及其类似物 抗菌肽是天然免疫的重要成分，其不仅具有抗菌、抗病毒等活性，某些抗菌肽还具有抗铜绿假单胞菌生物膜的活性。Lashua LP 等[23]研究表明，WLBU2 抑制生物膜与非生物表面以及与气道上皮细胞结合，且呈剂量依赖性；不仅如此，WLBU2 还明显增强了常用抗生素妥布霉素、环丙沙星、头孢他啶和美罗培南对铜绿假单胞菌的杀伤力。Taha MN 等[24]研究表明，LIVRHK 和LIVRRK 两种新型的合成肽虽然不抑制铜绿假单胞菌的生长，但能通过降低lasI、lasR、rhlI 和rhlR的基因表达水平，影响细胞膜及相关毒力因子的产生，包括胞外蛋白酶、鼠李糖脂等。Nisin 是一类具有抗菌性能的短阳离子两亲性肽，Wang SY 等[25]研究表明，Nisin 能抑制胞外多糖和e-DNA的产生，从而抑制铜绿假单胞菌在纳滤膜和PES 膜上的附着，进一步抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成。抗菌肽由于其种类丰富、很少产生耐药及强大的免疫调节的特点，是代替抗生素的理想物质，但是由于产量低、体内稳定性差、细胞毒性大、合成昂贵等原因，导致目前大规模临床应用仍有一定的困难。

2.5 中成药物 中药及中成药物使用历史悠久，近年来随着对中药成分及机制的研究，中药在抗生物膜方面的疗效也得到的越来越多的证实。Geng YF 等[26]研究表明，木犀草素能够通过降低QS 信号分子N-（3-氧十二烷基）-l-高丝氨酸内酯（OdDHL）和N-丁基-l-高丝氨酸内酯（BHL）的积累，下调QS 基因（lasR、lasI、rhlR 和rhlI）的转录水平，进而抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成。Majumdar M 等[27]研究表明，穿心莲内酯能通过减少细胞外聚合物质的含量，抑制细胞外蛋白酶的合成，从而达到抑制生物膜形成的作用，同时穿心莲内酯还可与常规抗生素如阿奇霉素等产生协同作用，将穿心莲内酯与阿奇霉素共同处理铜绿假单胞菌48 h，可使其生物膜减少92%。虽然有大量研究证实多种中药能通过各种途径抑制细菌生物被膜的形成，但中药对生物膜影响的相关研究还处于表面现象，对其相关机制的研究或将成为今后研究的重点。

2.6 新型材料 随着科技的发展，越来越多的新型材料与传统的医药结合，为解决铜绿假单胞菌生物膜相关的抗生素耐药的问题提供了全新的思路。Thorn CR 等[28]研究发现一种仿生纳米结构的脂质液晶纳米粒子LCNPs，在人支气管上皮细胞共培养模型中，雾化LCNPs 联合妥布霉素与单纯雾化妥布霉素相比，铜绿假单胞菌感染部位的抗生素浓度可提高100 倍，且新型纳米制剂能降低传统抗生素的使用剂量，同时增大抗生素的抗生物膜活性。Snk A等[29]研究发现，TPGS-PLGA 纳米粒显著提高了阿奇霉素的抗菌活性和生物膜预防活性，而OSA-HA纳米凝胶则降低了黏蛋白相互作用，同时还能消除已经形成的铜绿假单胞菌生物膜，降低阿奇霉素的使用剂量，改善阿奇霉素对肝细胞及上皮细胞的细胞毒性。使用纳米颗粒或纳米凝胶，包裹运送常规抗生素，以提高生物膜内药物浓度，降低细菌耐药及抗生素的使用剂量，是抗生物膜治疗非常有前景的途径。

2.7 物理疗法 随着抗菌素耐药菌株的增加，移植物表面生物膜相关感染也日趋增多，开发辅助性的方法治疗生物膜相关感染非常很重要。Pourhajibagher M等[30]研究表明，光动力疗法（PDT）可使铜绿假单胞菌abaI、agrA 和lasI的表达水平下调约3.7 倍，进而影响生物膜的形成。刘立婷等[31]研究表明，不同强度的低频超声联合环丙沙星干预治疗铜绿假单胞菌生物膜，可不同程度地破坏其生物膜结构，杀灭生物膜内细菌，且辐照剂量呈依赖性。

3 总结

虽然抗生素仍是临床中治疗感染的主要武器，但是由于抗生素研发难度大、研发周期长、耐药突变快等缺点及生物膜感染的治疗困难，临床迫切需要针对生物膜的特异性治疗方法和新的治疗方法来加强常规抗生素的使用。新型杀菌剂和抗生物膜菌剂和抗生物膜药物的使用，促进了生物膜的扩散，破坏了生物膜的自然发育阶段，为开发新的治疗方法提供了很好的途径。而日益明确的分子机制，也使靶向微生物生物膜制剂可能成为细菌根除的个性化方法。通过积极研究生物膜的复杂机制及抑制策略，制定精准化的治疗方案与措施，是未来治疗生物膜相关感染的方向。