韦丽君，苗鹏慧，孙赛楠，李楚珩，杨鑫雷

（河北农业大学 华北作物改良与调控国家重点实验室/华北作物种质资源教育部重点实验室/河北省种质资源实验室/农学院，河北 保定 071001）

花生是世界重要的油料作物和植物蛋白来源之一［1］。按照生长习性花生可以划分为直立型、半匍匐型和匍匐型三种植株形态［2］，而生长习性的建成主要受花生侧枝发育的影响。侧枝摆脱地心引力向上生长或屈服地心引力平伏生长，直接影响花生果针的入土距离、结果集中程度和耕作方式。鲁清等［3］研究认为适量增加侧枝与主茎的夹角，可有效减小果针入土距离，便于机械化收获，增加单株产量。

目前，关于植物侧枝的研究发现环境因素、植物激素、种植密度、糖类、营养物质和基因表达水平都参与植物侧枝调控［4］。转录因子在分枝发育过程中起着不可疏忽的重要调控作用，前人在水稻［5］、玉米［6］和番茄［7］等多种植物中均验证与分枝发育相关的重要基因。碱性亮氨酸拉链（Basic region/leucine zipper motif，bZIP）类转录因子广泛分布于在真核生物中且相对保守，参与调控植物生长发育、光信号转导、病害及胁迫应答等多种信号反应［8］。拟南芥AtbZIP60转录激活后与AtMYB7互作协同拮抗ABA 信号，促进种子萌发［9］。拟南芥GRF9通过激活表达bZIP 转录因子OBP3-RESPONSIVE GENE3（ORG3），负调控叶片生长，表现为叶片变小［10］。CmbZIP1主要在菊花的顶芽和腋芽中表达，过表达转CmbZIP1拟南芥较野生型分枝数变少［11］。水稻OsbZIP49过表达可使分蘖夹角增加，株型变得松散，主要是通过诱导IAA 酰胺合成酶来控制水稻的分蘖角和株型［12］。另外，bZIP 转录因子家族的明星基因HY5（ELONGATED HYPOCOTYL 5）可通过光信号间接影响特异性激素等基因通路来调控植物生长发育，转HY5拟南芥较野生型拟南芥植株分枝数显著增加［13-14］。在花生中，bZIP 转录因子的功能研究多与逆境胁迫应答相关［15-16］，而与生长发育的相关研究鲜见报道。

本研究在课题组前期花生bZIP 全基因组鉴定［15］和花生侧枝发育表达谱数据中［17］，发现AhbZIP4在不同生长习性的花生品种中表现出显著表达差异，推测其可能与侧枝发育相关。因此，本研究通过克隆、分析AhbZIP4基因的特征特性，构建融合载体明确基因在细胞中的表达位置；采用组织特异性表达分析探究基因在不同组织，尤其是在侧枝发育中的表达模式。研究结果将为花生侧枝发育提供新的基因资源，对进一步明确AhbZIP4基因参与调控侧枝发育的分子机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用侧枝生长习性直立花生品种‘冀花5 号’（JH5）和匍匐花生品系M130，由河北农业大学花生分子育种实验室提供。于2020 年4 月种植在河北农业大学创新生态园日光温室内，生长条件为白天28 ～30 ℃/16 h，晚上24 ～26 ℃/8 h，昼夜湿度控制在60%～70%。在苗期（播种后15 d）、开花期（播种后65 d）和结荚期（播种后100 d）分别取根、主茎、侧枝、叶、花等5 个器官组织；催芽播种后5、10、15、20、25 和30 d 的侧枝取样参考高斌［17］的方法。所有样品均设置3 次生物学重复，速冻于液氮中，存放于-80 ℃超低温冰箱备用。

1.2 试验方法

1.2.1AhbZIP4基因的获得 课题组前期通过直立型花生品种‘冀花5 号’和匍匐型种质资源M130 的侧枝发育转录组数据（BioProject ID: PRJNA675413）获得差异表达基因AhbZIP4。本研究从直立型品种JH5 叶片中，采用RNA 提取试剂盒（康为世纪）提取RNA，并反转录成cDNA（全式金反转录试剂盒）。根据AhbZIP4基因的CDS 序列，设计引物（见表1）。以1 μL cDNA 为模板，分别加入Pfu PCR Mix 25 μL、特 异 性 引 物 各1 μL，PCR 反 应 总 体 积 为50 μL。PCR 反 应 程 序 为94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35 个循环；72 ℃ 10 min。将扩增条带回收（Tiangen DNA 凝胶回收试剂盒）并送金唯智公司测序。

1.2.2 生物信息学分析 利用ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）、PSIPRED（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）、SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）、TMHMM2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/）、SignalP（www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）等在线软件分析基因蛋白理化性质、结构、跨膜结构域及信号肽等信息。采用Mega7.0 和GENEDOC 软件进行序列进化分析和多重序列比对分析。

1.2.3AhbZIP4基因亚细胞定位 采用限制性内切酶BsaⅠ和Eco31Ⅰ将PCR 产物和植物表达载体pBWA(V)HS-Glosgfp（武汉伯远）进行37℃双酶切1 h，获得线性化载体和目的片段；而后，采用T4 连接酶（Promega 公司）连接线性化载体和目的片段，连接体系为T4连接酶1 μL，10×buffer 1 μL，纯化产物2.5 μL，补超纯水至10 μL，16 ℃，3 h；将连接产物转化DH5α 鉴定阳性单菌落。将载体pBWA(V)HS-AhbZIP4-Glosgfp 质粒转化农杆菌EHA105 感受态，注射烟草叶片下表皮，弱光培养2 d，取标记的烟草叶片，制成玻片，激光共聚焦显微镜下观察拍照。

1.2.4 基因表达分析 实时荧光定量PCR 仪器为LightCycler 96 实时荧光定量PCR 仪，试剂为RT mix with DNase 升级款（购自苏州宇恒生物科技有限公司）。根据NCBI primer-Blast 设计qPCR 引物，以UBI1 为内参基因（表1）。反应体系和程序参考高斌的方法［17］。采用2-△△Ct方法［18］计算该基因在不同品种、不同时期、不同组织中的相对表达量。试验数据统计分析采用Graphpad Prism 8.0 软件。

表1 本研究中所用引物序列Table 1 Primer sequences in this study

2 结果与分析

2.1AhbZIP4基因克隆

以直立型花生JH5 叶片的cDNA 为模板进行扩增，利用Primer Premier5 设计特异性引物，PCR 克隆获得基因编码序列全长，琼脂糖凝胶电泳结果显示目的条带在1 182 bp 位置（图1），胶回收纯化后测序，测序结果显示与基因的CDS 序列一致，表明已成功克隆AhbZIP4基因（arahy.Tifrunner.gnm1.ann1.CS824N.1）的编码区，该基因位于四倍体栽培花生A01 染色体14 108 058 ～14 113 355 bp 位置。

图1 花生AhbZIP4基因琼脂糖凝胶电泳图Fig. 1 DNA Ladder ofAhbZIP4gene

2.2 生物信息学分析

2.2.1 蛋白理化性质和二级、三级结构预测 该基因cDNA 全长1 182 bp，编码393 个氨基酸。编码蛋白质分子质量为42.10 kD，等电点pI 为7.14，疏水性为-0.779。蛋白质二级结构预测显示（图2 左），该基因氨基酸序列α 螺旋占26.5%，无规则卷曲占65.75%，β 转角占3.25%和占4.5%的延伸链；根据基因的氨基酸序列预测蛋白三维模型（图2 右），显示该蛋白呈现典型的bZIP 拉链结构。

图2 AhbZIP4 蛋白质二级和三级结构预测Fig. 2 Prediction of secondary and tertiary structure of AhbZIP4 protein

2.2.2 信号肽、跨膜结构域和亚细胞定位预测 信号肽分析结果显示该蛋白无信号肽（图3 左），推测此蛋白是非分泌性蛋白，不能进行蛋白转运，一般在合成处发挥作用。跨膜结构域分析（图3 右），紫色线显示蛋白在outside 的概率几乎为100%，表明此蛋白无跨膜结构域，从而推测此蛋白在细胞内合成后不进行转运而是在细胞内部行使功能。亚细胞定位预测结果显示该基因定位在细胞核（95.7%）和细胞膜（4.3%）。

图3 AhbZIP4 信号肽和跨膜结构域Fig. 3 AhbZIP4 signal peptide and protein transmembrane region

2.2.3 系统进化分析和多重序列比对分析 将AhbZIP4基因序列利用NCBI-Blast 得到的同源序列进行系统进化分析，结果显示（图4），花生AhbZIP4 与大豆的GBF2A 和GBF2 以及红车轴草的WBR2同源性较高。多重比对分析显示（图5），AhbZIP4与同为豆科的作物氨基酸序列一致性较高，AhbZIP4 蛋白的同源序列存在2 个保守区域，为MFMR 和亮氨酸拉链(bZIP)区域（60 ～80 个氨基酸），MFMR 是G-box 家族的结合蛋白，可与bZIP 特异结合形成特异蛋白。

图4 AhbZIP4 蛋白的同源序列系统进化分析Fig. 4 Phylogenetic analysis of homologous sequence of AhbZIP4 protein

图5AhbZIP4氨基酸序列的多重比对分析Fig. 5 Multiple alignment ofAhbZIP4amino acid sequences

2.3AhbZIP4基因的亚细胞定位

利用BsaⅠ和Eco31Ⅰ将测序正确的PCR 产物和植物表达载体pBWA(V)HS-Glosgfp 进行双酶切，用T4连接酶将PCR 产物和线性化载体连接。将连接产物转DH5α 感受态细胞，挑取阳性单菌落进行测序，测序结果显示与该基因CDS 序列一致，表明重组质粒pBWA(V)HS-AhbZIP4-Glosgfp 构建成功（图6 左）。将重组质粒pBWA(V)HS-AhbZIP4-Glosgfp 转入烟草叶片，在荧光显微镜下观察蛋白表达。结果显示AhbZIP4的绿色荧光信号分布于细胞核和细胞膜中（图6 右），表明AhbZIP4定位在细胞核和细胞膜上，与亚细胞定位预测结果相符。

图6 AhbZIP4-GFP 载体图及亚细胞定位Fig. 6 Vector profile of AhbZIP4-GFP and subcellular localization

2.4AhbZIP4基因的组织特异性表达

为进一步探究AhbZIP4与侧枝发育的关系，我们检测了其在JH5 和M130 苗期、开花期和结荚期的根、主茎、侧枝、叶片和花中的表达特征。结果显示，AhbZIP4基因除在结荚期时的花中表达差异不显著，其他生育期的不同组织中均呈现显著或极显著表达差异，在2 个品种不同生育时期侧枝中的表达量变化趋势不同（图7）。苗期2 个品种在侧枝中基因表达量极显著差异与转录组侧枝发育关键时期差异相符（图8），推测该基因表达量的变化与侧枝发育的变化相关，从而间接影响花生株型的分化。

图7AhbZIP4在两个品种不同组织的表达模式分析Fig. 7 Expression pattern ofAhbZIP4gene in the two varieties of different organizations

图8AhbZIP4基因在不同品种侧枝和侧枝发育5～30 d 的表达变化趋势Fig. 8 Characteristics of the changing trend ofAhbZIP4gene expression in the development of lateral branches of different cultivars for 5-30 days

3 讨论

植物分枝习性长期以来备受育种家们关注，合理的分枝习性有利于作物产量提高和耕作方式优化。近年来，作物分枝习性的基因挖掘和作用机制的解析已在拟南芥和禾谷类作物中取得较大的进展［19-21］，大多数基因属于转录因子。bZIP 转录因子普遍存在于植物中，其家族成员都具有一个高度保守的bZIP 结构域（60～80 个氨基酸）。它由两部分组成：高度保守的结合DNA 的碱性区和多变的亮氨酸拉链区。在所有真核生物中都存在含有bZIP 结构域的蛋白，此类转录因子主要定位于细胞核中。本研究前期利用花生侧枝生长习性转录组分析，发现AhbZIP4基因在直立型品种JH5 中和匍匐型品系M130 中存在显著表达差异，推测该基因可能参与花生分枝习性的建成。本研究克隆的AhbZIP4基因具有典型的bZIP 结构域，且与前期栽培种花生bZIP 全基因组鉴定的结果一致［15］。前人研究中bZIP 转录因子家族的蛋白主要定位于细胞核中，部分定位于细胞质和细胞膜等其他细胞器中，外部环境以及蛋白互作也会对蛋白定位产生影响［17,22-25］。本研究中AhbZIP4 蛋白定位于细胞核与细胞膜中，与前人研究结果相符，定位于细胞膜是否与其他因素相关有待进一步验证。

迄今为止，bZIP 转录因子已被证明参与了多种生物学进程［26］。水稻中3 个bZIP 转录因子OsbZIP23、OsbZIP66 和OsbZIP72 与OsMFT2 相互作用且正向调控ABA 应答基因，并延缓种子萌发［27］。拟南芥AtbZIP29参与调控根尖分生组织细胞中细胞壁形成相关基因的表达从而抑制根的生长发育［28］。杨柳科树种杨树中推测bZIP 可能参与了枝条的次生生长［29］。拟南芥GBF1（bZIP）蛋白被Z-box 编码，在幼苗光形态发生中起着至关重要的作用，如抑制侧根的发育和促进子叶的扩展［30］。本研究克隆的AhbZIP4基因与大豆GBF2 和GBF2A 具有较高的同源性，它们均属于bZIP 转录因子家族G 亚族，该亚族成员能够特异结合光应答顺式作用元件G-box，推测AhbZIP4 基因可能通过光信号来调控分枝习性。正常光照条件下，本研究中花生侧枝发育5 ～30 d转录组数据显示，AhbZIP4基因在15 ～25 d 之间侧枝习性直立的品种表达量明显高于匍匐型，推测该基因可能与不同株型品种植株形态分化相关。本研究中AhbZIP4基因在侧枝发育过程中的表达模式，为进一步揭示bZIP 转录因子调控花生侧枝生长习性提供理论参考。