魏雅迪，曹丽萍，刘英姿，刘晓颖，曹宏哲，张 康，邢继红，董金皋

（1. 河北农业大学 真菌毒素与植物分子病理学实验室/河北省植物生理与分子病理学重点实验室，河北 保定 071000；2. 黑龙江省农业科学院 齐齐哈尔分院，黑龙江 齐齐哈尔 161000；3. 河北省承德市园林管理中心，河北 承德 067000）

灰葡萄孢（Botrytis cinerea）是一种引起植物灰霉病的重要病原真菌，它可以侵染蔬菜、水果等上千种寄主植物［1］。灰葡萄孢已成为研究植物病原真菌的模式病原菌，其生长发育和致病相关基因的功能与机制研究，不仅为深入研究灰葡萄孢生长发育和致病力的分子机理奠定基础，也为其他植物病原真菌的相关研究提供重要参考［2］。

异三聚体G 蛋白是普遍存在于真核生物中，参与多种重要的生理过程［3］。丝状真菌G 蛋白于1993 年首次报道，已明确其在生长、无性和有性发育中是必不可少的［4］；其中，G 蛋白α 亚基参与了营养感知、信息素反应以及致病等过程的调控［5］。Gα亚基在稻瘟病菌（Magnaporthe grusea）的生长、繁殖以及致病过程中都具有重要的作用［6］。灰葡萄孢Gα亚基位于cAMP 信号通路上游，参与病菌的菌丝生长、分生孢子发育、分生孢子萌发以及致病过程［7］。Gα亚基基因BcBCG1调控病菌的菌落形态和侵染能力，BcBCG2、BcBCG3基因的突变体可以对寄主进行侵染，但是与野生型相比侵染速度缓慢［8-9］，且BcBCG3基因的突变体分生孢子的发育和分生孢子萌发均具有特异性缺陷［6］。本实验室前期研究利用RNAi 技术获得了灰葡萄孢BcBCG2和BcBCG3基因的RNAi 沉默突变体，通过对突变体的表型和致病力进行分析，明确了BcBCG2和BcBCG3正调控病菌的菌丝生长、分生孢子的产量、致病力和穿透能力［10］。

灰葡萄孢BcPDR1基因为本实验室前期研究获得，利用基因敲除和互补回复技术明确了BcPDR1基因正调控病菌的菌丝生长、分生孢子和菌核的发育、菌丝侵染结构的形成以及致病力［11-12］。本研究利用qRT-PCR 技术分析BcPDR1基因突变对BcBCG2、BcBCG3基因表达的影响，以及BcBCG2、BcBCG3基因突变对BcPDR1基因表达的影响，确定BcPDR1基因与Gα 亚基基因之间的调控关系；在BcPDR1基因敲除突变体ΔBcpdr1的背景下，构建Gα 亚基基因中过表达菌株ΔBcpdr1/BcBcBCG2-OE 和ΔBcpdr1/BcBCG3-OE， 通 过 分析过表达菌株的表型和致病力，明确BcPDR1基因与BcBCG2、BcBCG3基因之间的关系，从而确定BcPDR1基因与病菌cAMP 信号通路之间的关系，为阐明灰葡萄孢BcPDR1基因调控病菌生长发育和致病力的分子机制提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

灰葡萄孢野生型菌株BC22、BcPDR1基因的T-DNA 插入突变体BCt89、敲除突变体ΔBcpdr1和 回 复 菌 株CE［13］，BcBCG2、BcBCG3基 因 的RNAi 菌株，均由河北省植物生理与分子病理学重点实验室/河北农业大学真菌毒素与植物分子病理学实验室保存及提供。

1.2 qRT-PCR 分析

利用qRT-PCR 技术，分析灰葡萄孢野生型菌株BC22，BcPDR1基因的缺失突变体BCt89和ΔBcpdr1和互补回复菌株CE 中的BcBCG2、BcBCG3基因的表达水平以及BcBCG2、BcBCG3基因的RNAi 沉默突变体中BcPDR1基因的表达水平。以灰葡萄孢Tubulin基因为内参基因，用BcBCG2、BcBCG3和BcPDR1基因的特异性引物（见表1），以各菌株的cDNA 为模板，进行qRT-PCR 分析。

表1 qRT-PCR 引物设计Table 1 Primers for qRT-PCR

1.3 Gα 亚基基因过表达菌株的构建

1.3.1 Gα亚基基因过表达载体的构建 用BcBCG2、

BcBCG3基因的特异性引物和灰葡萄孢野生型BC22菌株的cDNA 为模板，PCR 扩增BcBCG2、BcBCG3基因的编码区序列，电泳分离、纯化后进行克隆、测序。将测序正确的BcBCG2、BcBCG3基因序列与基因过表达终载体pEarly gate 103 连接，菌落PCR 和测序鉴定后，获得BcBCG2、BcBCG3基因的过表达载体pEarly gate 103-BcBCG2、pEarly gate 103-BcBCG3。

1.3.2 Gα 亚基基因过表达转化子的获得与鉴定 利用农杆菌介导的转化方法［14］，将pEarly gate 103-BcBCG2、pEarly gate 103-BcBCG3分 别 转化BcPDR1基因敲除突变体ΔBcpdr1中，获得转化子后在含有抗性的培养基中进行多次筛选，然后利用PCR 和qRT-PCR 技术分别从DNA 水平和转录水平对转化子进行鉴定。

1.4 Gα 亚基基因过表达菌株的表型分析

将灰葡萄孢野生型BC22 和突变体ΔBcpdr1、ΔBcpdr1/BcBCG2-OE、ΔBcpdr1/BcBCG3-OE 分 别接种在PDA 培养基上，20 ℃黑暗条件下培养7 d，对其菌落形态、菌核产生等表型进行观察；同时，收集各菌株的分生孢子，用血球计数板统计各菌株的分生孢子数量；制备各菌株的菌丝悬浮液，显微镜下观察其菌丝形态；分别将各菌株的菌盘（Φ=8.0 mm）接种在新的PDA 培养基上，20 ℃黑暗培养，每天定时测定各菌株的菌落直径，进而分析菌株的生长速率［15］

1.5 Gα 亚基基因过表达菌株的致病力分析

将灰葡萄孢野生型BC22 和突变体ΔBcpdr1、ΔBcpdr1/BcBCG2-OE、ΔBcpdr1/BcBCG3-OE 定量（菌盘Φ=8.0 mm）接种到离体的番茄果实上，检测各菌株的致病力，测量其病斑面积。

2 结果与分析

2.1BcPDR1基因对Gα 亚基基因表达的影响

利用qRT-PCR 技术，分析BcPDR1基因突变体Gα亚基基因BcBCG2、BcBCG3的表达情况。结果发现，BcPDR1基因缺失突变体BCt89 和ΔBcpdr1中BcBCG2、BcBCG3基因的表达水平显著高于野生菌株BC22 和回复菌株CE（见图1）。表明BcPDR1基因缺失影响了BcBCG2、BcBCG3基因的表达，也说明BcPDR1基因负调控BcBCG2、BcBCG3基因的表达。

图1BcPDR1基因突变体中BcBCG2和BcBCG3基因的表达分析Fig.1 Expression levels ofBcBCG2andBcBCG3inBcPDR1mutants

2.2 Gα 亚基基因对BcPDR1基因表达的影响

利用qRT-PCR 技术，分析Gα亚基基因BcBCG2、BcBCG3的突变对BcPDR1基因表达的影响。结果发现，BcBCG2、BcBCG3的RNAi 沉默突变体中BcPDR1基因的表达水平显著低于野生型菌株BC22（图2）。表明BcBCG2、BcBCG3基因突变影响了BcPDR1基因的表达，也说明BcBCG2、BcBCG3基因正调控BcPDR1基因的表达。

图2BcBCG2和BcBCG3基因突变体中BcPDR1基因的表达分析Fig. 2 Expression levels of theBcPDR1in RNAi mutants ofBcBCG2andBcBCG3genes

2.3BcBCG2、BcBCG3过表达菌株的构建

利用Gateway 技术，成功构建了BcBCG2和BCBCG3基因的过表达载体。利用农杆菌介导的遗传转化方法，将目的基因表达载体转入到突变体ΔBcpdr1中，通过抗性筛选获得转化子，在对转化子进行PCR 验证后进行qRT-PCR 分析。结果发现，BcBCG2、BcBCG3基因的转化子中BcBCG2和BcBCG3基因的表达水平显著高于突变体ΔBcpdr1（图3）。表明了BcBCG2和BCBCG3基因的过表达菌株ΔBcpdr1/BcBCG2-OE、ΔBcpdr1/BCBCG3-OE 构建成功。

图3BcBCG2和BcBCG3过表达菌株的基因表达分析Fig.3 Gene expression analysis inBcBCG2andBcBCG3overexpressing strains

2.4BcBCG2、BcBCG3过表达菌株的表型分析

对ΔBcpdr1/BcBCG2-OE、ΔBcpdr1/BCBCG3-OE 菌株的菌落形态、菌丝形态进行观察（见图4），发现过表达菌株ΔBcpdr1/BcBCG2-OE、ΔBcpdr1/BCBCG3-OE 的菌落灰褐色，产生大量菌核，菌丝灰黑色、分隔明显，与野生型BC22 的表型非常一致，而显著区别于BcPDR1基因的敲除突变体ΔBcpdr1。对过表达菌株的菌丝生长速率和分生孢子产量进行分析，发现ΔBcpdr1/BcBCG2-OE、ΔBcpdr1/BCBCG3-OE 菌株的生长速率和分生孢子数量均与野生型较为接近，其生长速率与野生型没有明显差别，其产孢量略低于野生型；过表达菌株的生长速率和分生孢子数量均显著区别于突变体ΔBcpdr1。表明BcBCG2、BcBCG3基因的过表达使突变体ΔBcpdr1的表型得到了恢复，也说明BcPDR1基因与BcBCG2、BcBCG3基因之间密切相关。

图4BcBCG2和BcBCG3过表达菌株的表型分析Fig. 4 Phenotypic analysis of over-expression isolates ofBcBCG2andBcBCG3

2.5BcBCG2、BcBCG3过表达菌株的致病力分析

以灰葡萄孢野生型BC22菌株和BcPDR1基因的敲除突变体ΔBcpdr1为对照，对ΔBcpdr1/BcBCG2-OE、ΔBcpdr1/BcBCG3-OE 菌 株 的 致 病力进行分析，发现接种野生型BC22 和过表达菌株的部位均能产生明显的病斑，且接种过表达菌株的病斑面积与野生型基本一致，而接种突变体ΔBcpdr1的部位并未产生明显的病斑（图5）。表明BcBCG2、BCBCG3基因的过表达均能使突变体ΔBcpdr1的致病力得到了恢复，进一步说明了BcPDR1基因与BcBCG2、BcBCG3基因之间密切相关。

图5BcBCG2和BcBCG3过表达菌株的致病力Fig. 5 Pathogenicity analysis of over-expression isolates ofBcBCG2andBcBCG3

3 结论与讨论

灰葡萄孢cAMP 信号途径在病菌的生长、发育和致病过程中起着重要作用。异源三聚体G-蛋白Gα 亚基由BcBCG1［7］、BcBCG2［16］、BcBCG3［17］基因编码，位于灰葡萄孢cAMP 信号途径上游，参与调控病菌的形态建成、分生孢子萌发和侵入生长［18］。其中，BcBCG1基因的缺失突变体ΔBcBCG1不能产生2 次扩展病斑，外源cAMP 的添加可以使ΔBcBCG1突变体的菌落形态恢复到野生型；BcBCG2、BcBCG3基因的缺失突变体ΔBcBCG2、ΔBcBCG3可以侵染寄主并能继续扩展，但是扩展速度较野生型缓慢［8-9］。ΔBcBCG3可以使分生孢子萌发受损并引起延迟发病。实验前期研究明确了灰葡萄孢BcPDR1参与病菌的生长、发育和致病力的调控［18］，但是灰葡萄孢BcPDR1与cAMP信号途径之间的关系并未明确［20］。因此，本研究首先利用qRT-PCR 技术，分析了BcPDR1突变体中BcBCG2、BcBCG3基因表达水平和BcBCG2和BcBCG3突变体中BcPDR1基因表达水平，结果确定了BcPDR1基因负调控BcBCG2、BcBCG3基因的表达，BcBCG2、BcBCG3基因正调控BcPDR1的表达，表明了BcPDR1基因与病菌的cAMP 信号途径密切相关。为进一步明确BcPDR1基因与BcBCG2和BcBCG3基因之间的关系，试验成功构建了BcBCG2和BCBCG3基因的过表达菌株ΔBcpdr1/BcBCG2-OE、ΔBcpdr1/BcBCG3-OE，然后对过表达菌株进行表型和致病力分析，确定了BcBCG2和BcBCG3基因的过表达能够使BcPDR1基因的敲除突变体ΔBcpdr1的表型和致病力得到恢复，表明了BcPDR1基因与BcBCG2和BcBCG3基因之间密切相关，同时说明了BcPDR1基因与病菌cAMP 信号途径之间具有相关性。但是BcPDR1基因与病菌cAMP 信号途径之间的调控关系及机制尚需深入研究，为阐明灰葡萄孢生长发育和致病力调控的分子机理奠定基础。