郑唐春，李璐璐，王 佳，程堂仁，张启翔

（花卉种质创新与分子育种北京市重点实验室，国家花卉工程技术研究中心，城乡生态环境北京实验室，园林环境教育部工程研究中心，林木花卉遗传育种教育部重点实验室，北京林业大学 园林学院，北京100083）

植物丰富多样的株型是经过长期进化和自然选择的结果，是遗传与环境互作的复杂调控过程［1］。木本植物按照枝型可以分为直枝、垂枝、曲枝等［2］。多样的植物株型性状在丰富园艺作物品种与促进农业生产中具有重要的应用价值。植株株型是由顶端分生组织（SAM）形成的分枝决定的。因此，枝条的数量和形态特征对园艺植物的株型至关重要。茎顶端分生组织和腋生分生组织（AM）的衍生物，产生植物除子叶以外的所有器官。植物新梢发育经历3 个阶段：腋生分生组织起始、叶芽初生生长和茎次生生长［3］。众所周知，芽的发育是一个由许多基因精心调控的生物过程，如腋生分生组织形成相关的Cup-shaped cotyledon(CUC)、Like Aux(LAX)、HD-Zip III 亚家族基因［4-5］，侧芽形成相关的Wuschel(WUS)和Clavata(CLV)等基因［6-8］，以及侧芽生长相关的More axillary branching(MAX)基因［9］。

HD-Zip III 转录因子是高等植物特有的转录因子，广泛参与植物生长和发育进程。在拟南芥中有5 个HD-Zip III 亚家族成员，包括Revolula（REV）、Phabulosa（PHB）、Phavolula（PHV）、ATHB8和Corona（CNA、ATHB15）［10-11］。 除 了ATHB8基因外，REV、PHB、PHV和CAN基因均在顶端分生组织中表达［12］。HD-Zip III 基因也在叶原基的近轴侧表达，并可调节叶片极性建立。REV基因在拟南芥中过量表达表现出远轴侧扁平叶和维管束的产生［11,13］。拟南芥rev突变体显著降低腋生分生组织活性和花茎分枝［14］，而REV功能获得突变体jba-1D 和avb1均表现出增大的顶端分生组织和增加的分枝表型，表明REV通过调节顶端分生组织活性来调节茎分枝［15］。在木本植物杨树中，REV的同源基因PRE（PtrHB2）和PtrHB7在形成层细胞分裂激活和次生生长过程发挥重要作用，其microRNA 靶点突变导致产生异常维管组织［16-17］。

梅花是中国传统名花，位居十大名花之首，有“花魁”之美誉，是我国著名的早春木本观赏植物。梅花虽然品种丰富，但存在株型单一、株型育种周期长等问题，无法满足市场多样化、新颖性产品需求，严重制约了梅花产业的可持续发展。前期在梅花中共鉴定出32 个HD-Zip 转录因子，RNA-seq 和qRT-PCR 分析显示HD-Zip III 亚家族基因在茎和叶芽中高表达［18］，推测HD-Zip III 在调节梅花分生组织分化和茎发育中起重要作用。本研究克隆出PmHB5基因和启动子序列并验证了PmHB5基因的时空表达和激素应答模式，以期为系统解析PmHB5调控梅花茎发育形成机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料与试剂

梅花‘飞绿萼’（P.mume‘Fei Lve’）1 年生枝条取自北京林业大学鹫峰国际梅园，采集后立即放入水中瓶插；用于RNA 提取的叶芽、茎段、叶片等材料液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱中。拟南芥（Arabidopsis thaliana，Col-0）和本氏烟草（Nicotianabenthamiana）由本实验室保存。pBI121-mgfp、pBI121、pCAMBIA1300super 和pCAMBIA1301 载体均由本实验室保存。TB Green® Premix ExTaq™II、PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒、限制性内切酶、PrimeSTAR HS DNA Polymerase、T4DNA 连接酶、In-fusion 重组酶等均购自TaKaRa 宝生物（北京）有限公司。其它试剂为进口或国产分析纯。

利用少量高浓度NaOH 溶液溶解IAA、GA3、BR、KT、ZA 粉末配制母液，随后用大量ddH2O 稀释至使用浓度。

1.2 试验方法

1.2.1 梅花不同组织样品收集、RNA 提取和cDNA合成 为了检测梅花PmHB5基因在不同组织的表达水平，选取长势健壮且一致的‘飞绿萼’3 株，收集叶片和不同发育阶段的茎（LBS Ⅰ，发芽阶段叶芽；LBS Ⅱ，展叶阶段叶芽；S1-5，第1-5 节茎尖；S6-10，第6-10 节茎；S11-15，第11-15 节茎），以及伸长生长枝条的韧皮部、形成层和木质部等液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱中。

利用天根RNA 提取试剂盒RNAprep pure Plant Kit 提取梅花不同组织总RNA 并利用NanoDrop-1000 测定样品RNA 浓度和质量，进一步使用1%琼脂糖凝胶电泳检测样品RNA 的完整性。参照PrimeScript RT reagent Mix with gDNA Eraser试剂盒操作流程将梅花总RNA 反转录为cDNA。

1.2.2 不同组织中PmHB5基因表达水平分析 利用IDT 在 线 软 件（https://sg.idtdna.com/scitools/Applications/RealTimePCR/）设 计 梅 花PmHB5基因特异性引物（表1）。使用PikoReal PCR 系统和TB Green Premix ExTaqII 试剂盒按照操作流程进行实时荧光定量PCR 反应（qRT-PCR），PCR 反应程序为：95 ℃ 3 min 预变性、95 ℃ 5 s 变性、60 ℃20 s 退火，设置为40 个循环。在60 ～95 ℃范围内记录溶解曲线。以PmPP2A作为参考基因［19］（表1），设置3 个生物学重复。数据下机后利用采用2-△△Ct法计算目的基因相对表达量［20］。

1.2.3 外源激素处理下PmHB5基因表达水平分析 为了检测梅花PmHB5基因对不同激素处理的响应情况，选取长势基本一致的‘飞绿萼’植株3株，分别取3 枝基部已木质化的当年生枝条插入100 μmol/L 的IAA、GA3、BR、KT、ZA 溶液中侵泡12 h，以ddH2O 处理为空白对照，取溶液面以上2 cm 的茎段用于提取总RNA 并反转录为cDNA，利用qRT-PCR 检测不同激素处理后PmHB5的表达情况。

1.2.4PmHB5基因和启动子克隆 根据梅花基因组中PmHB5基因的侧翼序列设计引物（表1）。以梅花嫩茎cDNA 为模板，通过PCR 反应扩增目的基因。PCR 程序为：98 ℃ 5 min；98 ℃ 30 s；57 ℃30 s；68 ℃ 3 min；68 ℃ 5 min；反应35 个循环。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶（w/v）电泳后，使用天根Universal DNA 纯化回收试剂盒（DP214）回收目的片段连接至亚克隆载体pEASY®-Blunt Cloning Vector，转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞，挑选阳性克隆并送生工生物工程(上海)股份有限公司（简称“上海生工”）测序。

使用多糖多酚植物基因组DNA 提取试剂盒提取‘飞绿萼’叶片DNA，并以此为模板，根据PmHB5基因上游2 000 bp 序列设计特异性引物（表1）扩增启动子片段。PCR 产物经过1%琼脂糖凝胶电泳后，胶回收目的片段连入pEASY®-Blunt Cloning Vector 上，转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞后挑选阳性克隆送上海生工公司测序。

1.2.5 植物表达载体构建 为验证梅花PmHB5基因的亚细胞定位情况，根据PmHB5基因碱基序列，去掉终止密码子，根据pCAMBIA1300super 载体序列和PmHB5基因序列设计带有载体同源臂的引物（表1）。通过PCR 扩增反应出扩增目的条带并利用Sma I酶切pCAMBIA1300super 载体，使用In-fusion 连接酶将纯化后的PCR 产物连入pCAMBIA1300super 载体。进一步转化大肠杆菌DH5α 并挑选阳性克隆送上海生工公司测序。

为验证梅花PmHB5基因启动子时空表达模式，将梅花PmHB5基因启动子克隆纯化后，利用Xba I和Kpn I限制性内切酶连入到pBI121-mgfp载体上，构建pBI121-PmHB5pro-GUS，驱动报告基因GUS基因表达。

1.2.6 亚细胞定位 选取测序正确的质粒pCAMBIA1300super-35S::PmHB5-GFP转化农杆菌GV3101 感受态。将成功转化目的质粒的菌株在添加50 mg/L 卡那霉素和50 mg/L 利福平的LB 液体培养基中，37 ℃ 200 r/min 过夜培养至OD600值为0.4，5 000 r/min 离心5 min 收集菌体，使用重悬液重悬菌团至OD600值为0.6 后加入200 μmol/L 乙酰丁香酮制作侵染液。

选取生长2 个月的本氏烟草植株，利用注射器将重悬后的农杆菌菌液注射进烟草叶片背面，暗培养24 h 后光照培养48 h。经50 ng/mL 4',6- 二脒基-2- 苯基吲哚二盐酸盐（4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride，DAPI） 溶 液 染 色15 min 后，利用Leica TCS SP8 激光共聚焦显微镜（Leica, Wetzlar, Germany）观察绿色荧光在细胞中的分布情况并拍照。

1 2.7 拟南芥遗传转化与GUS 组织染色 将构建好的pBI121-PmHB5pro-GUS转入农杆菌GV3101 感受态，选取初花期拟南芥植株，利用花序浸染法转化拟南芥。将收获的T0代种子播种在含有50 mg/L卡那的筛选培养基上，筛选阳性植株并提取叶片DNA 作为模板，利用GUS基因特异性引物（表1）验证转基因植株。

表1 本文使用的引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

将不同生长状态的转基因拟南芥幼苗和不同组织浸泡在GUS 染色液中，使用真空泵将气压维持在0.01 Pa 大约30 min 排出组织间气体。随后置于37 ℃培养箱中染色5 ～7 h，随即利用卡诺固定液固定过夜，75%酒精浸泡2 ～3 d 完全褪色后，使用Leica ED4 体式显微镜拍照（Leica，德国）。

2 结果与分析

2.1PmHB5基因和启动子克隆与序列分析

利用梅花嫩茎cDNA 克隆获得PmHB5基因序列，测序结果显示PmHB5编码区包含2 523 个核苷酸序列，编码840 个氨基酸。相比于梅花参考基因组，‘飞绿萼’PmHB5基因编码序列中存在3 个单碱基突变，蛋白序列无差异，包含18 个外显子（图1A）。通过ExPASY 网站在线分析，推测该基因含有保守的HOX 和START 结构域，编码蛋白的分子量为大约92.89 kD，等电点为5.83（图1B）。PmHB5基因的启动子序列中存在大量光响应元件，包括AE-box、Box 4、I-box、GT1-motif、G-box、GT1-motif、TCT-motif。同时，存在许多与激素响应相关的顺式元件（P-box、TATC-box、TCA element、ABRE、TGA-element、AuxRR-core、TGACG-motif、CGTCA-motif、ERF）和芽和分生组织特异性表达元素（as-2-box、CAT-box 和O2-site），推测PmHB5基因参与调控分生组织和茎的发育（图1C）。

图1 梅花PmHB5基因和启动子的结构及生物信息学分析Fig. 1 Structure and bioinformatics analysis ofPmHB5gene and promoter sequences

2.2PmHB5表达模式分析

利用qRT-PCR 方法检测PmHB5在不同器官（叶片、叶芽和不同发育阶段茎）中的表达水平，结果显示PmHB5基因在叶片、叶芽和茎中均有不同程度的表达，PmHB5在LBII、S1-5、S5-10、S11-15中的表达量均显著高于叶片中表达量（图 2A）。进一步研究PmHB5在茎发育中的功能，从茎中分离出韧皮部、形成层和木质部，qRT-PCR 结果显示，PmHB5基因在形成层和木质部中的表达量均显著高于韧皮部中的表达量（图 2B），表明PmHB5可能在细胞分化和枝条木质化过程中起到重要作用。

生物信息学分析显示，PmHB5基因中存在miRNA 的靶位点，推测miR165/166可能对PmHB5基因存在转录后调控，利用qRT-PCR 对miR165和miR166在梅花嫩茎不同组织中的表达量进行测定，结果表明miR165和miR166的表达量均在韧皮部中表达量最高，在形成层中最低，韧皮部中miR165的表达量为木质部中的171 倍，而形成层中的miR165的表达量仅为韧皮部的15.2%（图 2C）；韧皮部中miR166的表达量为木质部中的342 倍，同样形成层中的miR166的表达量仅为韧皮部的7.6%（图2C）。相关性分析表明，miR165和miR166在梅花茎不同组织中的表达量呈正相关，相关系数达0.999 98，miR165和miR166与PmHB5的 表 达 量呈显著负相关，相关系数绝对值均大于0.96（图2D）。综上，梅花miR165和miR166在木质部、形成层和韧皮部中的表达量和PmHB5基因呈相反趋势。

图2 梅花PmHB5和miR165/166在不同组织中的表达模式分析Fig. 2 Expression analysis ofPmHB5andmiR165/166in different tissues

2.3PmHB5基因对不同激素处理的响应

为了验证PmHB5基因能否响应激素处理，使用100 μmol/L 的生长素（IAA）、赤霉素（GA3）、表油菜素内酯（BR）、激动素（KT）、玉米素（ZA）对离体枝条进行处理12 h 后，检测PmHB5基因表达情况。定量结果表明梅花PmHB5基因均能够响应GA3、IAA、ZA、KT 和BR 激素处理。BR 处理后，PmHB5表达量变化最大，显著上调了2 039 倍；KT 处理后，PmHB5的表达量上调了15.4 倍；IAA处理后，PmHB5的表达量上调了36.4 倍；而使用两种细胞分裂素（ZA 和KT）处理后，PmHB5基因的表达量也显著升高（图3）。

图3PmHB5基因对不同激素处理的响应Fig. 3 The response ofPmHB5to different hormone treatments

2.4PmHB5基因启动子功能验证

为研究PmHB5启动子的功能，通过拟南芥花序侵染法，利用农杆菌将pBI121-PmHB5promoter 转移到拟南芥基因组中并对转基因植株进行GUS 组织染色。结果表明PmHB5主要在花芽分生组织、侧芽分生组织、花朵、幼嫩叶片以及茎的维管组织中等细胞分裂和分化活跃部位表达（图4A-F）。茎解剖结构显示，PmHB5主要在形成层和发育中的木质部中表达（图4G-H）。此外，PmHB5基因在花瓣的维管组织中表达量较高（图4C）。根据PmHB5基因的表达部位推测其参与调控顶端分生组织和维管分生组织的发育、分化和维持。

图4PmHB5基因启动子驱动GUS 在拟南芥中染色Fig.4 GUS staining driven byPmHB5promoters in stem ofArabidopsis thaliana

2.5PmHB5基因亚细胞定位

为研究PmHB5基因的亚细胞定位情况，将去掉密码子的PmHB5序列连入带有GFP 蛋白的pCAMBIA1300super 载体中， 将重组后的pCAMBIA1300super-35S::PmHB5-GFP亚细胞定位载体通过瞬时转化法转化本氏烟草叶片。激光共聚焦显微观察结果表明，转化pCAMBIA1300super 空载体的烟草叶片下表皮细胞中，绿色荧光信号在全细胞内均能被检测到，而转化pCAMBIA1300super-35S::PmHB5-GFP载体的烟草叶片中，仅在细胞核中检测到绿色荧光信号（图5），表明PmHB5是定位在细胞核上的转录因子。

图5 PmHB5 蛋白亚细胞定位Fig. 5 Subcellular localization of PmHB5 proteins

3 结论与讨论

HD-Zips 蛋白属于同源异型盒基因家族，是植物高度保守的一类转录因子，常以二聚体形式识别DNA 上的一对对称序列，并作为转录激活子或者抑制子调控靶基因表达，其调控活性受microRNA 调控［21］。HD-Zip 蛋白广泛参与植物发育过程，如维管发育、器官形成、分生组织维持、逆境响应等［22］。HD-Zips 依据DNA 结合域同源性被分为HD-Zip（I-IV）4 个亚家族。HD-Zip III 是维持茎尖分生组织模式所必需的转录因子，其功能缺失或功能获得突变会改变维管束模式，从而影响茎的形态建成。

梅花PmHB5在未展叶的叶芽（LBSII）和茎顶端（S1-5）中有较高的表达水平，在梅花茎次生生长过程中，PmHB5在形成层中表达量最高，在分化木质部中次之。转基因拟南芥GUS 组织染色结果表明梅花PmHB5基因主要在分生组织、维管组织等细胞生长和分化活跃的部位中表达。Ko 等通过半定量RT-PCR、Northern blot 和原位杂交等方法证明银白杨（Populus alba）HD-Zip III 亚家族基因PtaHB1主要在木质部中表达，且在枝条木质部形成过程中表达量逐渐升高［23］。杉木ClHDZ2和ClHDZ3主要在茎中表达且表达量均随着木质化程度的提高而增强，推测其参与杉木木质部的发育［24］。取百日草（Zinnia elegans）嫩茎进行原位杂交试验，结果表明ZeHB-10、ZeHB-11和ZeHB-12基因主要在原形成层和分化木质部中表达［25］，与PmHB5在梅花中的表达模式基本类似。基于PmHB5基因在茎中的表达模式推测其在梅花茎中参与调控细胞分化和枝条木质化过程。

HD-Zip III 基因在多种植物中被报道能够响应多种激素诱导。外施IAA 可以促进拟南芥ATHB-8基因表达［26-27］，在百日草中，油菜素类激素能够诱导ZeHB-10、ZeHB-11和ZeHB-12表 达［25］，使 用BR处理后，巨桉（Eucalyptus grandis）中PHB、PHV和ATHB15的表达量显著升高［28］。水稻OsHox10基 因 能 够 响 应JA 和ABA 处 理［29］，在 光 皮 桦（Betula luminifera）中，HD-Zip III 基因BlHDZ2、BlHDZ3、BlHDZ4、BlHDZ5均 能 响 应IAA 处 理，BlHDZ1和BlHDZ2能够响应油菜素内酯处理，GA、IAA、BR 和乙烯利（Ethephon）处理后的第2 天，BlHDZ4表达量升高［29］。在本研究中，通过对梅花PmHB5基因启动子中顺式作用元件预测发现，PmHB5基因启动子中存在大量光响应元件和多种激素响应顺式作用元件，包括IAA、SA、ET、MeJA、GA 和ABA 等。使用不同激素处理梅花枝条，qRTPCR 检测结果表明，PmHB5基因能够响应GA3、IAA、ZA、KT 和BR 等激素诱导，这与长白落叶松HD-Zip 基因对外源激素的响应模式类似［31］。Chip-Seq 试验证明拟南芥HD-Zip III 亚家族转录因子REV能够直接作用于多个HD-Zip II γ 和δ 组基因启动子，包括HAT22、HAT14、HAT1、ATHB2、ATHB4等基因，这些基因被报道能够响应光敏色素参与红光/远红光（R: FR）诱导的荫蔽反应，在荫蔽环境下促进拟南芥下胚轴伸长［32-35］。生长素在调控植物在荫蔽环境中的下胚轴伸长方面起着至关重要的作用，REV转录因子通过直接激活调控色氨酸依赖途径的生长素合成［36］以及生长素运输相关基 因（LAX2）和LAX3的 表 达［37］。HD-Zip III 和KANAD1 转录因子通过相互拮抗共同调控器官或组织的极性发育，如茎顶端分生组织、叶片原基、茎和根的维管组织等［38-40］。另外，HD-Zip II 和HD-Zip III 和miR165/166之间存在一个反馈调控网络。在叶片原基中，miR165/166在远轴面抑制HD-Zip III 亚家族基因REV的表达，而在叶原基远轴面，HD-Zip II 亚家族HAT3和ATHB4转录因子能够与REV结合形成异源二聚体抑制miR65/166的表达从而促进HDZip III 亚家族基因的表达。3 类基因的相互作用共同维持了组织特异性发育的平衡，导致了扁平叶片的形成［41-42］。