王雪,康敏,王偲媛,曹卫星,朱艳,刘兵

(南京农业大学国家信息农业工程技术中心/智慧农业教育部工程研究中心/农业农村部农作物系统分析与决策重点实验室/江苏省信息农业重点实验室/现代作物生产省部共建协同创新中心,江苏 南京 210095)

水稻(OryzasativaL.)是我国重要的粮食作物,全国65%以上的人口以稻米为主食。水稻光合作用不仅直接影响其干物质生产及产量形成,同时还是衡量农田碳汇能力的重要指标之一[1]。根据光合-CO2响应曲线(A-Ci)获得的光合参数,可作为衡量水稻光化学效率的指标[2-3]。传统的光合-CO2响应曲线测量方法(A-Ci)是基于气体交换原理,采用稳态测量的方式获得,每一个测试点达到稳态都需要1～3 min,因此测试一条完整的曲线一般需要耗时20～35 min[4-6],且一条曲线通常只包含十多个数据点。近年来,光合测量系统LI-6800中新提出了一种光合-CO2响应曲线快速测量方法,即快速A-Ci响应(RACiR)曲线。与A-Ci技术相比,RACiR技术采用了非稳态测量的方式(即在短时间内迅速改变气体交换装置内参考室和样本室的CO2浓度),最高以100 μmol·mol-1·min-1的速度来改变CO2浓度,实现光合-CO2响应曲线的测试,最短5 min就可获得最大Rubisco羧化速率(Vmax)和最大电子传递速率(Jmax)等参数,且1条曲线的数据密度是A-Ci技术的10倍之多[7]。因此,采用更快捷、更合适的测试方法以及数学模型来拟合水稻光合-CO2响应曲线,有助于提高水稻光合作用测试的效率及准确度,为研究未来气候变化背景下CO2浓度升高对水稻光合作用的影响具有重要意义。

在光合作用的测量方式和数据拟合模型方面已有大量研究[6-8]。通过光合-CO2响应模型可以解析饱和CO2浓度(Cisat)、最大净光合速率(Pnmax)、CO2补偿点(Γ*)、光呼吸速率(Rd)和初始羧化效率(α)等重要光合参数[4,8]。目前最常用的光合-CO2响应模型有生化模型(FvCB)[9],在此基础上衍生出不同A-Ci曲线拟合模型,如直角双曲线模型[10]、Michaelis-Menten模型[11]、非直角双曲线模型[12]、叶子飘模型[13]、指数函数模型[14]、指数修正模型等[15]。这些模型已应用于定量研究CO2浓度升高影响植物光合生理生态方面[16-17]。大部分模型是在FvCB模型基础上,采用不同A-Ci曲线拟合方法,但其测量方式没有根本变化。近年来,随着测量仪器的更新换代,新的测试方法如快速光合-CO2响应(RACiR)曲线被提出[18-19]。相比于传统的稳态测量方法,RACiR技术是一种基于非稳态测试方法的叶片尺度气体交换测量方式,可在更短时间内获取基本的光合特征参数。该方法推出后在短时间内获得了较多的关注和应用。

本研究采用快速光合-CO2响应(RACiR)曲线技术与传统的光合-CO2响应曲线(A-Ci)技术对水稻光合作用进行测试,采用8种光合-CO2响应模型对所测量的数据进行拟合分析,并对获取的光合特征参数进行比较。通过比较2种测试方法和8种CO2响应模型在水稻光合-CO2响应曲线分析中的拟合效果及潜在问题,为水稻光合-CO2响应曲线选用合适的测试方式和拟合模型,同时为未来高通量光合表型获取技术等提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

分别于2020年和2021年在温室和大田进行水稻光合作用测试,用于检验2种测试方法和不同的CO2响应模型是否适用于不同环境下的光合作用测试。

1.1.1 试验1由北京力高泰科技有限公司的工程师提供数据,该数据于2020年11月6日在湖北省武汉市华中农业大学温室(114.37°E,30.48°N)内完成测试,供试水稻品种为‘丰两优香1号’。供试材料于9月中旬播种,育秧至3叶1心期移栽至约10 kg土的塑料桶中在温室栽培,栽培管理措施均按照该品种的品种特性进行,以避免生物和非生物胁迫。

1.1.2 试验22021年8月在江苏省如皋市国家信息农业工程技术中心试验示范基地(120.33°E,32.23°N)进行测试,供试水稻品种为‘淮稻5号’。供试材料于5月中下旬播种,育秧至3叶1心期移栽。按照当地水稻种植标准进行除草和病虫害管理,以避免生物和非生物胁迫。

1.2 CO2响应曲线测试

1.2.1 传统光合-CO2响应(A-Ci)曲线测试测试时间为水稻开花期,在晴天08:30—11:30,采用便携式光合仪LI-6800(LI-COR,Lincoln,USA)对各环境下的水稻剑叶净光合速率(Pn)进行测试。选用光合仪内置光源将光合有效辐射控制在1 500 μmol·m-2·s-1,温度控制在(25±2)℃,CO2浓度设置为400、300、200、100、50、400、400、600、750、1 000、1 200、1 400、1 600、1 800、2 000 μmol·mol-1。每个CO2浓度最低等待时间为2 min,最高等待时间为6 min,测定部位为主茎剑叶。

1.2.2 快速光合-CO2响应(RACiR)曲线测试RACiR曲线测试与A-Ci测试同步进行。测试时间为水稻开花期,选择晴天08:30—11:30,采用便携式光合仪LI-6800测量Pn。选用光合仪内置光源将光合有效辐射控制在1 500 μmol·m-2·s-1,温度控制在(25±2)℃,湿度控制在55%。先在自动程序界面中的AutoLog设置大于测试时间的自动记录程序,数据记录时间间隔2 s。同时在环境界面中应用Auto controls控制参比室CO2浓度(CO2_r):先在2 min内从400 μmol·mol-1降至0 μmol·mol-1,再在15 min之内从 0 μmol·mol-1升至1 500 μmol·mol-1,其余操作如空叶室校正等参照北京力高泰科技有限公司提供的 LI-6800 实验手册,测定部位为主茎剑叶。测试数据参照Stinziano等[7]的方法进行分析,公式如下:

AEC=m×[CO2]ret-b

(1)

Aleaf=Aapparent-AEC

(2)

式中:AEC为空叶室产生的CO2表观净同化速率的偏差值;Aleaf为经过校准后的叶片CO2净同化速率;Aapparent为CO2表观净同化速率;[CO2]ret为空叶室内CO2以100 μmol·mol-1·min-1从500 μmol·mol-1到 0 μmol·mol-1线性降低;m为斜率绝对值;b为截距。利用模型计算得到最大羧化速率Vc,max以及最大电子传递速率Jmax。

1.3 CO2响应模型介绍

1.3.1 FvCB模型C3植物的净光合速率受CO2浓度、温度、光照强度、叶肉导度、Rubisco酶活性、RuBP浓度等因素的限制[8,20-21]。Farquhar等[9]于1980年提出了C3植物的光合生化模型(简称FvCB模型):

(3)

式中:Pn为植物的净光合速率;Ac为Rubisco限制下的羧化速率;Aj为RuBP再生限制下的羧化速率;Ap为磷酸丙糖利用率(TPU)限制下的潜在羧化速率;Г*为叶绿体CO2光合补偿点;Ci为胞间CO2浓度;Rd为线粒体暗呼吸速率。

1.3.2 直角双曲线模型直角双曲线模型由Baly[10]的推导公式而来,是植物净光合速率对CO2响应的经验模型,计算公式如下:

(4)

式中:α为初始羧化效率(即Pn-Ci曲线在Ci=0时的斜率);Rp为光呼吸速率;Pnmax为最大净光合速率。

1.3.3 叶子飘模型该模型由Ye[13]于2007年提出,在直角双曲线模型的基础上进行了修正。叶子飘模型可较好拟合低光照强度和光抑制下植物的净光合速率:

(5)

式中:b为模型的修正系数;c为CO2响应曲线的初始斜率与最大净光合速率的比值(b、c单位均为 mol·μmol-1)。

1.3.4 非直角双曲线模型非直角双曲线模型由Thornley[12]于1976年提出,计算公式如下:

(6)

式中:θ表示Pn-Ci曲线的弯曲程度(0<θ≤1)。

1.3.5 Michaelis-Menten模型Michaelis-Menten模型(简称M-M模型)由Harley等[11]于2010年提出,计算公式如下:

(7)

式中:K表示米氏常数。

1.3.6 指数函数模型指数函数模型有多种表达式,公式(8)由Bassman等[14]提出的指数函数模型转化而来,计算公式如下:

(8)

1.3.7 指数函数修正模型Chen等[15]于2011年提出了指数函数修正模型,计算公式如下:

Pn=de-gCi-fe-hCi

(9)

式中:d、f、h、g为模型的系数。

1.3.8 分段函数模型分段函数模型由段爱国等[22]于2009年提出,原模型基于二次多项式将弱光和强光分段拟合,计算公式如下:

(10)

式中:αd表示弱光阶段的表观量子效率;a、b、c均为模型的系数。

1.4 数据分析方法

直角双曲线模型、非直角双曲线模型、指数函数模型、M-M模型拟合测试数据均在叶子飘开发的光合计算软件中实现。利用OriginPro2021自定义指数函数修正模型和分段函数模型,再对测试数据进行拟合。FvCB模型拟合测试数据通过R语言中racir、plantecophys等程序包实现。

2 结果与分析

2.1 不同CO2响应曲线测试方法的测量特性

分析2种光合-CO2响应曲线技术的耗时,发现在测试过程中RACiR技术可以在短时间内迅速调整CO2浓度,同时利用IRGA对这种迅速变化进行精确测量,从而在较短时间内完成光合-CO2响应曲线的测量。但RACiR技术需要进行空叶室的校正测量,且所耗费时间与RACiR测量设定的时间需一致。另外RACiR测试的快慢也是相对而言,如果CO2浓度变化幅度较大,在考虑数据稳定性的情况下,测1条完整的光合-CO2响应曲线也需要耗费15～20 min(表1)。理论上,在不考虑空叶室校正耗费的时间上,RACiR比A-Ci测试耗时要节约近50%的时间。

表1 A-Ci和RACiR完成1条完整光合-CO2响应曲线测试耗时Table 1 Time consumed for one measurement of A-Ci and RACiR tests

2.2 A-Ci和RACiR拟合参数的比较

测量光合-CO2响应曲线后,利用模型计算得到碳同化过程中有关生化限制的机制参数,如最大羧化速率(Vc,max)以及最大电子传递效率(Jmax)等。RACiR测试方法开发的主要目的也是表型研究中求Vc,max和Jmax,其对暗呼吸速率Rd的参数计算不太稳定。本研究结果表明,RACiR与A-Ci的测试结果具有较高的一致性。由于光合-CO2模型均由FvCB模型演化或者简化而得,本研究首先运用FvCB模型对2种测试方法所测得的数据进行拟合分析(图1、2),结果表明除暗呼吸速率(Rd)在RACiR和A-Ci之间有较大差异外,2种方法在考虑叶片自身差异所带来的误差下,所测的各特征参数差异均在可接受误差范围内(图3,表2)。

图1 基于A-Ci采用FvCB模型模拟不同CO2浓度下的光合速率Fig.1 Simulated photosynthetic rates of A-Ci by FvCB model at different CO2 concentrations

图2 基于RACiR采用FvCB模型模拟不同CO2浓度下的光合速率Fig.2 Simulated photosynthetic rates of RACiR by FvCB model at different CO2 concentrations

图3 不同CO2浓度下A-Ci与RACiR光合速率实测值Fig.3 Measured photosynthetic rates of A-Ci and RACiR at different CO2 concentrations

表2 基于FvCB模型拟合A-Ci和RACiR曲线得到的水稻叶片光合特征参数Table 2 Photosynthetic characteristic parameters fitted by FvCB model from A-Ci and RACiR curve in leaves of rice

2.3 不同光合-CO2响应模型拟合效果的比较

由于试验1与试验2结果相似,本研究主要采用7种由FvCB简化的光合-CO2响应模型来拟合试验1中A-Ci和RACiR的测试数据(图4),各模型拟合R2均大于0.98,说明拟合程度较好。在光合特征参数上,各模型则有不同的表现,模型拟合出的初始斜率即初始羧化效率(α)为0.08～0.18,其中叶子飘模型、非直角双曲线模型、指数函数模型、指数函数修正模型的计算结果均较为接近,而直角双曲线模型所模拟的值则略高于其余模型。在最大净光合速率(Pnmax)的模拟中,叶子飘模型、指数函数修正模型、分段函数模型的模拟值与实测值最为接近,其余模型都存在较大程度的高估,特别是直角双曲线模型与M-M模型。在CO2饱和点即胞间CO2饱和点(Cisat)的模拟中,叶子飘模型、指数函数修正模型的模拟值与实测值最为接近,其余模型都存在较高程度的高估或者低估。而CO2补偿点即胞间CO2补偿点(Г*)的模拟中,只有分段函数模型的模拟值严重低估(表3、4)。光呼吸速率各模型的差异则较大,总体变化为-8～11 μmol·m-2·s-1。

图4 基于A-Ci(A)和RACiR(B)采用7种模型模拟不同CO2浓度下的光合速率Fig.4 Simulated photosynthetic rates of A-Ci(A)and RACiR(B)by 7 models at different CO2 concentrations

表3 利用7种光合-CO2响应模型拟合试验1的A-Ci曲线得出的特征参数Table 3 Characteristic parameters fitted by seven CO2 response models with A-Ci curve in Experiment 1

表4 利用7种光合-CO2响应模型拟合试验1中RACiR曲线得出的特征参数Table 4 Characteristic parameters fitted by seven CO2 response models with RACiR curve in Experiment 1

3 讨论

3.1 不同光合-CO2响应模型的比较与评价

为了更便捷地研究高等植物的光合生理生态以及评估全球CO2浓度升高对植物的影响,前人提出了许多光合-CO2响应模型及其改进版本。本研究比较了2种光合-CO2曲线测试方法,并利用目前应用较为广泛的7种由FvCB模型简化而来的光合-CO2曲线拟合模型进行相关参数的拟合。综合比较7种模型的模拟值与实测值,发现叶子飘模型较为可靠,若单看某一光合特征参数的话,则各模型各有优缺点。模型的拟合结果很大程度上依赖各模型的调参算法,部分模型需要不断调整参数限定范围才可以得出较为理想的参数值,调参过程较为繁琐,且多数情况下仅通过R2值大小并不能判断拟合的参数值是否符合实际。其中,对直角双曲线模型、非直角双曲线模型、M-M模型来说,如果利用Pnmax=CE×Cisat-Rp计算CO2饱和点,则CE的计算受到数据点数量和质量的影响。如果在CO2浓度≤200 μmol·mol-1范围内的测试数据点较少,会使得计算出的CE与实际相差较大。指数函数模型在计算CO2饱和点时对假设条件也有要求,究竟是假设净光合速率为0.99Pnmax还是0.9Pnmax时所对应的CO2浓度为CO2饱和点取决于实测值,并不是选择0.99Pnmax和0.9Pnmax都能成功计算出CO2饱和点。由于在CO2浓度>200 μmol·mol-1时是基于二次多项式进行模拟的,因此分段函数模型在曲线最高点后不会有“平台阶段”(即CO2浓度达到一定水平后净光合速率保持不变的阶段),这本身与植物实际的光合生理不太相符。另外,M-M模型和直角双曲线模型拟合出的参数值几乎一样,其他模型在计算光合参数时则表现出一定的差异。在计算CO2补偿点时,最好能有较多的净光合速率<0的数据点才比较准确。但传统光合-CO2响应曲线(A-Ci)测试基本上只有1～2个点Pn<0,数据点的数量有限,可能会影响CO2补偿点的计算。

3.2 RACiR与A-Ci光合-CO2响应曲线测试方法的比较

RACiR测试方法很大程度上提高了光合-CO2曲线的测试效率,同时在一定程度上降低了由于测试时间较长带来的酶激活状态的变化、叶绿体的移动及气孔开度变化带来的误差。本研究结果表明,RACiR测试方法所获得的各特征参数的可靠性与A-Ci相似,且其相对于传统的测试方法可缩短50%左右的时间。但同时RACiR测试方法也存在一些弊端。其一,采用RACiR方法测试时不能同步测量荧光参数。荧光参数的测量需要在几秒内进行饱和脉冲,这与RACiR方法测试时需要在短时间内迅速调整叶室内CO2的浓度并记录相冲突。其二,同一测试者无法同时操作多台仪器进行RACiR的测试。这主要是因为RACiR测试过程中需要测试者时刻关注仪器的状态变化并进行相应操作。其三,RACiR方法在测试过程中不能实时查看数据是否存在异常,主要是由于RACiR方法需要通过空叶室校正后才能得到最终需要的数据,且测量数据的准确性依赖于空叶室校正的准确性。其四,RACiR方法容易因为操作问题而无法获取CO2补偿点的实测值。一般C3植物的CO2补偿点在40～50 μmol·mol-1,如果低CO2浓度(低于200 μmol·mol-1)下出现数据异常,则不能得到胞间CO2补偿点。

随着近些年作物表型组学在育种中的作用不断凸显,高通量表型获取需求也更加强烈[23],而测试时间较长一直是光合表型高通量获取的难点。RACiR方法的高效性将为未来高通量的光合表型获取提供有力的技术支撑。由于本研究仅仅是做比较分析,并未针对所发现的RACiR方法测试过程中存在的弊端做相应的改进工作,今后的研究更需要关注如何在提高光合测试效率的同时解决以上弊端。另外,虽然本研究中RACiR方法的测试时间相对于A-Ci测试方法缩短约50%,但若想发展成为高通量的测试技术仍需进一步提高测试效率。同时,由于RACiR所用的CO2浓度变化速率局限于100 μmol·mol-1·min-1,不能更快,因此RACiR也存在一定的局限。近年来也有学者提出新的非稳态测量技术即动态吸收测量技术(DAT),其CO2浓度变化速率最快可达400 μmol·mol-1·min-1[24]。在植物胁迫和表型平台的研究中为了获得更高的测试效率也可以不进行完整的曲线测试,而对200～800 μmol·mol-1CO2进行测试,测试时间可以进一步下降50%。非稳态的光合测量技术将为突破光合参数获取时间限制提供重要技术手段,后续可进一步围绕非稳态的测量技术探究一种更高效便捷的测量方法。

本研究通过采用快速光合-CO2响应曲线(RACiR)可使水稻光合生理研究者在保证数据与传统光合-CO2响应曲线(A-Ci)相似的基础上,在一定程度上提高光合-CO2响应曲线测试效率,且由于测试的数据量大,在光合模拟上也更容易获得稳定的特征参数。综合比较7个由FvCB模型简化而来的模型后,发现叶子飘模型拟合出的光合特征参数较为可靠,且其开发的光合计算系统拟合得到的参数也较为稳定合理。本研究结果将为水稻光合作用-CO2响应的生理生态研究选用合适的测试方式和拟合模型以及未来高通量光合表型获取技术提供理论依据。