谢 辉,刘中凯,耿永强,冯建萍,多杰昂欠,金 星

在鼠疫疫源地监测中,当动物鼠疫处于流行末期或静息期,由于鼠疫菌毒力减弱或完全丧失,不能致动物死亡,但存在于动物体内,由于菌量减少,若按一般常规培养基分离鼠疫菌比较困难,因此进行培养时必须要求特别敏感的增菌培养基分离鼠疫菌,而且自然界鼠疫菌一般从自毙动物体内分离,由于自毙动物腐败,从一个污染的材料中分离鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌),受变形杆菌、革兰氏阳性菌的影响鼠疫菌分离困难[1]。因此研制及应用一种分离鼠疫耶尔森氏菌的选择培养基,可以提高鼠疫菌的分离率,是野外鼠疫监测现场及实验室研究的关键技术。现有鼠疫菌的选择培养基主要有龙胆紫培养基,在实际工作中,这2种培养基分离污染材料中的鼠疫菌效果不理想,本研究根据鼠疫菌培养特性,在基础培养基中加入可以刺激鼠疫菌生长的生化试剂和抑制变形杆菌及革兰氏阳性菌的试剂,研制出2种选择敏感培养基(1%枸椽酸钠选择培养基和4%十二烷基硫酸钠选择培养基),通过实验菌株在以上2种培养基的生长测试,并收集野外材料现场分离,比较2种选择敏感培养基对于鼠疫菌的检出性能和检测效果,初步评价其应用效果。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 腐败材料 搜集野外动物材料(旱獭,犬)共5份,其中1号和4号旱獭仅剩股骨残骸,2号、3号旱獭及5号犬脏器高度腐败,但仍保留心、肝、脾、肺,各脏器均有不同程度溃烂。

1.1.2 实验菌株 耶尔森氏菌属的鼠疫疫苗株(EV菌株)、假结核耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌以及野外腐败材料常见杂菌:变形杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、A群链球菌均由鼠疫菌专业实验室提供。

1.1.3 仪器设备 Synbiosis Proto col3全自动菌落计数器,英国Symbioses公司;低氧细胞工作站H45 HEPA,英国DWS公司;Ⅱ级B2型生物安全柜,贺利氏HERAsafe生物,德国Heraus公司,中国细菌浊度标准管(批号2018-1)由中国药品生物制品检定所提供。

1.2 方 法

1.2.1 基础培养基的制备 赫氏琼脂,含牛肉消化液200 m L,水800 m L,蛋白胨10 g,琼脂14 g,乳糖10 g,调p H7.2～p H7.4。对照培养基:1%溶血赫氏培养基,将基础培养基121℃高压灭菌30 min后冷却至50℃左右,冷却后加入10%脱纤维兔溶血,混匀后倾注平皿。

1.2.2 龙胆紫培养基 龙胆紫0.1 g加无水乙醇2 m L溶解后,加蒸馏水至90 m L,121℃高压灭菌30 min高压灭菌后冷却至50℃加入新鲜血液10 m L,混合后取10 m L加入基础培养基1 L,制备成含有1/10万龙胆紫溶血琼脂培养基。

1.2.3 1号培养基(4%十二烷基硫酸钠选择培养基) 十二烷基硫酸钠4 g,红霉素0.5 mg,胆盐3号5 g,阿莫西林12.5 mg,甘露醇1 g,中性红0.03 g)。2号培养基(1%枸橼酸钠选择培养基) 去氧胆酸钠1 g,枸橼酸钠1 g,枸橼酸铁1 g。将以上2种选择培养基试剂分别经121℃高压灭菌30 min后冷却至50℃的1000 m L基础培养基中,即组成不同的选择培养基,4℃保存备用。

1.2.4 鼠疫耶尔森氏菌在3种选择培养基生长能力的测定 将鼠疫EV菌株28℃培养48 h,制成浓度为1000个菌/m L菌悬液,取0.1 m L分别接种以上3种选择培养基和对照培养基,置于28℃温箱培养24～48 h,实验重复3次,观察记录平板单个菌落生长情况。

1.2.5 3种培养基敏感性及特异性检测 将各实验菌株(耶尔森氏菌属的鼠疫EV菌株、假结核耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌)、野外腐败材料常见杂菌(变形杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、A群链球菌)制成菌悬液,根据比浊管稀释成1000个菌/m L菌悬液,取0.1 m L涂布到4种培养基上,实验重复3次,28℃孵箱培养24～48 h,观察细菌生长情况。

1.2.6 腐败动物材料鼠疫菌分离培养 采集腐败动物脏器材料(旱獭和犬的股骨、肝、脾),分别接种3种选择培养基,28℃孵箱培养24～48 h,观察鼠疫菌生长及分离情况。在各选择培养基上挑选可疑鼠疫菌菌落经鼠疫噬菌体实验确诊为鼠疫菌,以上实验均以1%溶血赫氏培养基为对照培养基。

1.2.7 菌落计数 参考《GB 4789.2—2016,菌落总数测定》。

2 结果

2.1 鼠疫菌在3种选择培养基的生长情况及特异性检测 1号培养基中的鼠疫耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌生长良好,均为玫红色菌落,鼠疫菌发育成熟,菌落中心呈淡红色(见图1)。金黄色葡萄球菌和链球菌不生长,大肠埃希氏菌生长受抑制,菌落计数少。变形杆菌的弥漫性生长受抑制,呈单个菌落;2号培养基可见大肠埃希氏菌生长,其它各实验菌株生长均受抑制;鼠疫菌在龙胆紫培养基上生长,菌落稍隆起,半透明略带蓝灰色,镜下观察鼠疫菌菌落形态不典型,生长缓慢,变形杆菌在龙胆紫培养基上生长受抑制,呈单个菌落,大肠埃希氏菌长满整个平板。结果见表1。

图1 鼠疫菌在选择培养基和赫氏培养基中生长情况Fig.1 Yersinia pestis growth in selective medium and Hexcelite medium

表1 鼠疫菌在4种培养基生长情况Tab.1 Growth of Yersinia pestis in four culture media

2.2 选择敏感培养基敏感性的测定 鼠疫菌在龙胆紫培养基和2号培养基敏感性差,鼠疫EV菌液浓度为10－7时,未见鼠疫菌生长,1号培养基在10－8时依然有菌生长,其敏感性与赫氏培养基一致,见表2。

表2 鼠疫耶尔森氏菌在各培养基敏感性检测结果Tab.2 Sensitivity tests of Yersinia pestis in each medium

2.3 脏器检验结果 应用选择培养基检测腐败材料中鼠疫菌,结果见表3。

表3 选择培养基检测腐败材料结果Tab.3 Selective medium for detection in spoiled materials

3 结 论

鼠疫菌的分离是所有鼠疫预防和控制工作的前提和核心,对于任何从鼠疫监测现场带回的鼠疫宿主动物或动物遗骸,鼠疫专业人员会尽一切努力分离鼠疫菌,并保存鼠疫菌种[2],分离鼠疫菌的基础是选择适合的培养基并能快速挑选目的菌。传统分离鼠疫基础培养基是赫氏培养基,鼠疫菌在赫氏培养基上通过低倍显微镜能见灰白色小菌落,镜下可见菌落中心隆起、表面有黄褐色粗糙颗粒,边缘不整齐呈薄而透明的花边状,为典型鼠疫菌成熟菌落形态[3],这需要专业人员凭丰富的经验、扎实的专业知识来辨别鼠疫菌并根据鼠疫菌噬菌体裂解实验来确定鼠疫菌。但在实际工作中,由于鼠疫菌在不同因素影响下其形态表现为多样性[4];自然界存在不被噬菌体裂解的鼠疫菌[5],因此仅从菌落形态及噬菌体裂解实验进行判断易漏诊。本研究是结合鼠疫菌特异性酶的特征,在赫氏消化液基础上研制鼠疫菌选择敏感培养基,这其中,赫氏消化液用于增菌[6-7],1号培养基含0.5%胆盐,具有高度特异性,含有甘露醇同时具有鉴别作用[8]。

通过对3种选择培养基敏感性和特异性检测,可以看出3种选择培养基中,龙胆紫培养基和1号培养基对鼠疫菌的生长和选择能达到基本检出的要求,1号培养基可以检出10－1个菌/m L,敏感性高于龙胆紫培养基,与基础培养基无统计学差异(P值和统计方法)。鼠疫菌株在1号培养基经28℃培养24 h即可生长发育成熟,菌落呈玫红色,具备鼠疫菌典型结构(菌落花边大,中央颗粒粗糙),变形杆菌、大肠埃希氏菌及革兰氏阳性杆菌生长均受抑制,结果显示该培养基特异性好。龙胆紫培养基是分离鼠疫菌常用选择性培养基,可以抑制变形杆菌和革兰氏阳性菌,但大肠埃希氏菌在该培养基上生长良好,并且抑制鼠疫菌的正常生长,据此龙胆紫选择培养基在野外污染严重材料的鼠疫菌培养中应用不理想,只适于实验室动物感染试验或污染不严重时鼠疫菌的分离[9],例如在鼠疫菌的毒力测定等实验,鼠疫菌在2号培养基生长发育差,菌落呈灰白色,与其它杂菌不易区分,不适于鼠疫菌分离培养。

3种选择培养基应用于动物疫情的检测,1号培养基与龙胆紫培养基的检出结果符合率为100%。由于野外动物材料腐败,其中01和04旱獭只剩股骨残骸,对照培养基各脏器变形杆菌弥漫性生长,覆盖少许鼠疫菌,导致分离困难,应用1号选择培养可抑制变形杆菌弥漫性生长,玫红色鼠疫菌生长良好,极易挑选。龙胆紫培养基上鼠疫菌亦可检出,但生长缓慢,培养24～48 h依然为初级菌落。狗脏器培养显示携带噬菌体合并杂菌污染,赫氏培养基上无法挑选鼠疫菌,通常需应用抗噬菌体血清培养基分离鼠疫菌,但在野外无法制备,本研究应用1号选择敏感培养基,鼠疫菌24 h发育成熟,菌落呈玫红色,结构典型,能抑制杂菌生长,鼠疫菌易于挑选,不足之处在于鼠疫菌分离后依然携带噬菌体,所以分离后需在专业实验室进行抗噬菌体血清培养基进一步分离培养后菌株方能保存。实际检测可看出1号培养基效果优于龙胆紫培养基。

01号培养基是笔者自主研发的显色培养基,该培养基是利用显色培养基的原理[10-12],使用中性红为显色底物,在鼠疫菌特异性酶作用下酵解甘露醇产酸[13],中性红指示剂在酸性环境中产生红色集团附着于菌落上,使鼠疫菌菌落显示红色,同时添加抑制变形杆菌和革兰氏阳性菌的试剂,十二烷基硫酸钠,红霉素,胆盐3号,阿莫西林,对变形杆菌、大肠杆菌和革兰氏阳性菌抑制作用强,适用于检验腐败和杂菌污染的动物材料,而且生长的鼠疫菌菌落典型,易于挑选,在野外材料鼠疫菌分离有实际意义,使用该培养基应注意耶尔森氏菌属中与鼠疫菌近源的假结核杆菌、小肠结肠炎菌都具有能发酵甘露醇的特异性酶,在实际应用中分离疑似菌后应做噬菌体裂解实验和鼠疫核酸检测以确证。

利益冲突:无

引用本文格式:谢辉,刘中凯,耿永强,等.一种选择敏感培养基对腐败材料检测鼠疫耶尔森氏菌检测的应用效果[J].中国人兽共患病学报,2022,38(10):906-909,930.DOI:10.3969/j.issn.1002－2694.2022.00.134