黄慧珍 王松松 林 凡,2 李晓冉 苏陈颖 林晓晖,2 张捷平,2

(1 福建中医药大学中西医结合学院,福州,350122; 2 中西医结合慢性病研究福建省高校重点实验室,福州,350122)

糖尿病是一种严重的慢性代谢性疾病,其中约90%为2型糖尿病(Diabetes Mellitus Type 2,T2DM)[1]。中医学认为T2DM早期发病机制是阴虚燥热[2],将糖尿病归属于中医消渴证范畴[3]。《神农本草经》中记载,石斛具有补五脏虚劳羸瘦、益胃生津、滋阴清热的功效,是治疗“消渴证”的要药[3]。现代药理研究表明,石斛具有调节脂类代谢,改善胰岛素抵抗和糖耐量,抑制炎症反应,促进葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽(Glucose-dependent Insulinotropic Peptide,GIP-1)等降血糖激素分泌的作用[4]。但是石斛治疗T2DM具体机制尚不明确,影响其进一步开发与利用。

网络药理学的系统性和协同性与中医整体观念具有共同之处,将“一靶一药”转变为“网络靶点、多成分”,被广泛用于探索中药治疗疾病的分子药理学机制[5-8]。本研究通过分析石斛的活性成分及其靶点,应用网络药理学方法探讨石斛治疗T2DM的分子机制,为其进一步深入研究奠定基础。

1 资料与方法

1.1 数据库与软件 选取中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP,http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php),有机小分子生物活性数据库(PubChem,https:/pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/),BioMart数据库(http://www.biomart.org/),人类蛋白质参考数据库(Human Protein Reference Database，HPRD),瑞士靶预测数据库(Swiss Target Prediction，http://swisstargetprediction.ch/),人类基因数据库(GeneCards,https://www.genecards.org/),OmicShare网站(http://www.omicshare.com/),网络拓扑属性分析软件Cytoscape(3.8.0),Pubmed数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

1.2 石斛活性成分及其靶点、T2DM基因的获取 通过Pubmed数据库进行文献挖掘,以“石斛”“化合物”等为关键词,获取已知的石斛成分,并利用TCMSP,根据口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)>20%筛选出可能的活性成分。随后采用化学相似性的方法,通过检索Swiss Target Prediction、PubChem数据库,获取石斛活性成分的靶点(P≥0.8)。从GeneCards数据库中检索收集T2DM的疾病基因。

1.3 石斛活性成分-靶蛋白相互作用网络构建 将石斛活性成分及其对应的靶蛋白导入Cytoscape(3.8.0),构建“石斛活性成分-靶蛋白”网络,并进行网络拓扑学分析,评价石斛各活性成分与靶蛋白的关联度。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction,PPI)网络的构建与分析 通过HPRD数据库获取人类PPI数据,导入Cytoscape(3.8.0)作为背景网络;利用1.2所得石斛活性成分靶点和T2DM基因分别构建“石斛活性成分靶点-人类蛋白”PPI网络、“T2DM疾病基因-人类蛋白”PPI网络;将上述2个PPI网络映射获得“石斛靶蛋白-T2DM相关蛋白”PPI网络,并进行网络拓扑结构分析,预测石斛治疗T2DM的分子机制。以节点的自由度值代表与该节点相连边的条数,以中介中心性描述该节点在网络中的作用和影响程度。这2个参数值越大,说明该节点在网络中的作用越重要,以提示其所代表蛋白在石斛治疗T2DM中的作用大小。

1.5 基因本体(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析 将1.4分析所得石斛治疗T2DM靶点导入BioMart数据库转换基因格式,通过Omishare平台进行GO富集分析与KEGG通路富集分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 T2DM基因、石斛活性成分及其靶点的获取和筛选 通过文献检索收集到石斛活性成分391种,主要包括生物碱类、黄酮类、酚类、萜类等,其中OB>20%的活性成分有15个。获得57个活性成分潜在作用靶点(P≥0.8)(表1),其中木犀草素(Luteolin)和芹菜素(Apigenin)的靶蛋白数量分别为31个、27个。将石斛活性成分及其对应的靶蛋白导入Cytoscape(3.8.0)进行可视化分析,网络拓扑分析结果也表明木犀草素和芹菜素是作用靶蛋白数量最多的活性成分(图1),提示二者可能为石斛发挥作用的关键成分。通过检索Gene Cards数据库,获取T2DM基因5 436个。分析表明,77%石斛活性成分靶蛋白为T2DM基因,提示石斛具有治疗T2DM作用。

2.2 “石斛靶蛋白-T2DM相关蛋白”PPI网络的构建与分析 分别构建“T2DM疾病基因-人类蛋白”和“石斛活性成分靶蛋白-人类蛋白”PPI网络,映射获得“石斛靶蛋白-T2DM疾病相关蛋白”PPI网络。见图2。根据拓扑分析结果,石斛活性成分可直接或间接作用于917个T2DM疾病相关蛋白(40个靶蛋白及877个靶蛋白相互蛋白),占“石斛活性成分靶蛋白-人类蛋白”PPI网络节点数的99%,再次提示石斛治疗T2DM的作用。其中,自由度和中介中心性均为前10位的节点包括肿瘤蛋白P53(Tumor Protein P53,TP53)、E1A结合蛋白P300(E1A Binding Protein p300,EP300)、雌激素受体α(Estrogen Receptor Alpha,ESR1)、酪蛋白激酶2α(Casein KinaseⅡAlpha,CSNK2A1)等。见表2。这些节点属于网络关键节点,是沟通其他节点的关键,可能在石斛治疗T2DM中发挥重要作用。

2.3 GO与KEGG通路富集结果与分析 KEGG分析结果获得162条信号通路(P<0.01),将前30条通路转化为柱状图。见图3。主要有AGE-RAGE通路、PI3K-AKT通路、叉头框O(Forkhead Box O,FOXO)通路等。自由度和中介中心性均为前10位的节点中,TP53、蛋白激酶C-α(Protein Kinase C alpha,PRKCA)富集在PI3K/AKT通路;EP300、SMAD家族成员3(SMAD Family Member 3,SMAD3)、SMAD家族成员2(SMAD Family Member 2,SMAD2)富集在FOXO通路;SMAD3、SMAD2、PRKCA同时富集在晚期糖基化终末产物-晚期糖基化终末产物受体(Advanced Glycosylation End Products-Receptor of AGEs,AGEs-RAGE)通路;SRC原癌基因、非受体酪氨酸激酶也可能通过AGEs-RAGE信号通路,在T2DM的病情进展中发挥作用[8]。已知,PI3K/AKT、FOXO以及AGEs-RAGE信号通路可通过氧化应激、炎症反应和胰岛素抵抗参与T2DM及其并发症的发生发展。石斛可能通过关键预测靶蛋白调节上述信号通路在T2DM中发挥作用。

3 讨论

本研究通过网络药理学技术分析石斛在治疗T2DM中的靶向作用,对其相关的分子机制进行探讨。通过化合物-靶点网络图分析,关键化合物为黄酮类化合物木樨草素,其次是芹菜素,分别对应靶基因31个、27个。木犀草素和芹菜素是具有抗糖尿病作用的氧化型黄酮中药单体成分。木犀草素和芹菜素均能通过与自由基反应,提高机体抗氧化能力,缓解糖尿病大鼠的氧化应激反应,减轻胰岛细胞的氧化损伤[9-10]。其中,木犀草素通过抑制p38通路与核因子κB的激活,减少炎症介质和氧化应激指标的表达,发挥对胰腺组织、脑组织、糖尿病心肌病的保护作用[11];芹菜素能显著改善糖尿病大鼠血糖、血脂水平,抑制肝组织形态学改变和脂肪变性[10,12]。

通过“石斛靶蛋白-T2DM疾病基因”PPI网络拓扑分析,石斛可能通过40个靶蛋白及877个靶蛋白相互蛋白对T2DM起治疗作用,TP53、EP300、SRC、ESR1、SMAD3、PRKCA、CSNK2A1、SMAD2为网络中的关键靶蛋白。其中,TP53、ESR1、CSNK2A1参与对胰岛素的调节过程,TP53激活,促进胰岛细胞的衰老,导致胰岛素抵抗[13];ESR1可增强胰岛素敏感性,改善糖、脂代谢紊乱,当表达缺陷时可导致胰岛素抵抗[14-15];CSNK2A1可促进胰岛素分泌[16];SMAD3、SMAD2可促进糖尿病鼠纤维化相关基因表达,导致肝脏纤维化[17]。

提取重复节点并导入OmicShare网站进行GO和KEGG通路分析,GO富集结果(P<0.05)显示,重复节点主要富集于酶结合、蛋白结合、转录因子结合等分子功能,以及细胞过程正调控、代谢过程正调控和对内源性刺激的应激反应等生物学过程,其中代谢紊乱、氧化应激以及对炎症介质应答能力下降会导致T2DM及其并发症的发生与发展[7]。

通过KEGG信号通路分析,AGEs-RAGE相互作用启动信号转导级联,引起氧化应激,促进T2DM及其血管并发症的发生发展。机体内活性氧的生成增多和清除力下降被称为氧化应激,活性氧在体内蓄积引起机体氧化损伤[19]。AGEs和RAGE结合后,激活PI3K/AKT通路,PI3K/AKT通路激活还原型辅酶Ⅱ氧化酶,促进活性氧的生成,使氧化应激作用增强导致组织损伤[10],同时进一步激活MAPK等介导的信号通路,使核因子κB活化[18],反馈性刺激RAGE以及炎症介质、内皮素、黏附因子、促凝血组织因子等基因的表达,使血流调节受损[19],同时触发瀑布式炎症反应,引起细胞损伤和功能紊乱。随着RAGE表达增加,糖尿病鼠内皮细胞显著减少,细胞凋亡和粥样斑块的炎症反应增加,促进免疫细胞聚集在炎症部位[20-21],最终促进T2DM的发展及其血管并发症的发生,如微血管并发症糖尿病肾病、神经病变、视网膜病变;大血管并发症动脉粥样硬化等。

AGEs-RAGE信号通路还可通过激活FOXO相关转录因子等机制导致胰岛素抵抗。胰岛素抵抗是T2DM的发病基础,可导致胰岛素维持血糖稳态的能力下降[22]。FOXO蛋白可促进脂质代谢,其中FOXO1和FOXO3参与了肝脏葡萄糖代谢和脂质代谢的调节。FOXO1可促进脂肪细胞中脂肪三酰甘油脂肪酶(Adipose Triglyceride Lipase,ATGL)的表达,并以ATGL依赖的方式促进肝细胞中脂肪酸氧化(Fatty Acid Oxidation，FAO);此外,FOXO蛋白可作为胰岛素作用的直接靶点。在PI3K/AKT信号通路中,胰岛素水平和蛋白激酶B活性增加,可以促进肝脏中FOXO蛋白磷酸化增加,使FOXO蛋白功能降低,导致胰岛素抵抗[23-24]。

本研究发现,关键靶蛋白TP53、PRKCA富集在PI3K/AKT通路;EP300、SMAD3、SMAD2富集在FOXO通路;SMAD3、SMAD2、PRKCA同时富集在AGEs-RAGE通路,提示石斛可能通过富集在AGE-RAGE、PI3K-AKT、FOXO信号通路上的关键靶蛋白在T2DM的治疗中发挥作用。与上述结果相一致的是,一些研究也表明石斛多糖和石斛酚可以抑制PI3K/AKT信号通路和AGEs-RAGE信号通路,减弱该通路介导的核因子κB激活、细胞内信号转导等生物学效应[25-27]。

综上所述,石斛可能主要通过木樨草素、芹菜素影响TP53、EP300、SRC等关键预测靶蛋白的表达,进而调控AGE-RAGE、PI3K-AKT、FOXO等信号通路,抵抗氧化应激、抑制炎症反应和胰岛素抵抗,调节糖脂代谢,从而在治疗T2DM中发挥作用。这为应用石斛治疗T2DM提供了一定理论依据,为进一步阐明其作用机制奠定了基础。