韩 梅，黄有军

（浙江农林大学，浙江杭州 311300）

脂类是非常重要的细胞成分，在细胞功能中发挥着关键作用[1]。研究脂质的改变对阐明潜在生物标志物的作用机理及其对各机体的系统影响有着巨大贡献。脂质组学是代谢组学的分支，由于脂质相对其他代谢物具有独特性和功能特异性，现已独立为单独学科；脂质组学分析技术，将用于脂质提取物和完整组织样本的脂质组学分析[2]。

1 脂质组学简介

脂质组学，涉及到对单个细胞脂类的精确识别，包括每种脂类中单个原子的类型和数量，以及它们与邻近脂类和蛋白质的立体电子相互作用[3]。脂质组学概念的提出近20 年[4]，主要研究各机体的脂类物质，鉴定脂类分子在蛋白表达和基因代谢中的调控机制，并分析研究差异脂质及其代谢物的变化规律在机体中的联系和作用[5]。它对各脂类物种的精确量化，在脂类代谢途径、基因调控和系统构建方面发挥着重要作用。

2 脂质组学分析方法

主要包括免疫测定方法、散弹枪脂质组学和基于色谱分离的质谱方法[6]。其中，酶联免疫吸附测定法在多数实验室都很流行，操作简单，容易获得，但当较多异构体可与各种抗体交叉反应时，其特异性就存在问题，限制了其用途[7]。现重点介绍散弹枪脂质组学和基于色谱分离的质谱法的优缺点及其应用。

2.1 散弹枪脂质组学

又名鸟枪法，它利用每种脂类的独特化学和物理性质，直接从生物样品的有机提取物中对细胞脂质组进行大规模的高通量分析。简而言之，将有机提取物直接注入离子源的方法，被称为散弹枪脂质组学。

它的主要优势是，直接注射时，可在恒定浓度的溶液中获得感兴趣的脂类单个分子物种的分子离子质谱，包括直接注射和电喷雾分离技术在内的散弹枪脂质组学，因其灵敏度高、效率高、重现性好、覆盖面广而成为脂质组学的基本分析技术平台。该方法可直接从提取物中进行脂类的鉴定和定量，不需要进行色谱分离[8]。但该方法不适用于大量样品的分析，当样品量超过30h，可能会交叉污染。综上所述，散弹枪脂质组学是小样本油中脂质简单快速鉴定的一种很好的选择。

基于散弹枪脂质组学独特的特点和使用的质谱仪，至少有3 种不同的散弹枪脂质组学方法，包括串联质谱法，以及质量精度更高的基于MS 和多维MS-SL（MDMS-SL）已被开发出来，并在文献中得到了很好的记录[9]。MDMS-SL 最大限度地利用了离散脂类中固有的独特化学和物理特性，能分析非常低的丰度水平，克服了其他散弹枪脂质组学方法的多数局限性，是直接从生物样品的脂质提取物中分析脂质最有力的工具之一，它可对数千种不同的脂类进行高精度分析[10]。Kui等[11]利用多维质谱的散弹枪脂质组学（MDMS-SL）分析小鼠大脑和心脏脂质提取物，可直接从大脑和心脏提取物中鉴定和描述乙烯醚双甘油酯分子物种，这种方法将有助于识别乙烯醚连接的双甘油酯在脂质代谢和信号传导中的作用，以及它们在疾病状态中的适应性改变。Jun 等[12]用MDMS-SL 分析了ob/ob 小鼠及野生型对照在10、12 和16 周龄时的心脏、肝脏、肾脏和骨骼肌的细胞脂质体，发现ob/ob 小鼠的脂毒性脂类（包括NEFA、溶血磷脂、Cer、DAG 和TAG）水平显著高于对照组，脂类的比例在年龄和器官依赖方式下有所不同，揭示了ob/ob 小鼠的脂肪生成和脂肪毒性可能有助于胰岛素抵抗，并为糖尿病和肥胖的潜在机制的研究提供了很好的见解。

为研究丙型肝炎病毒HCV 诱导的脂质组成变化，Sarah 等[13]对全细胞提取物和亚细胞室进行了定量散弹枪脂质组学研究，证实了中性脂质的高水平与人类免疫缺陷病毒形成对比，这些脂病毒颗粒显示出类似于极低密度或低密度脂蛋白（VLDL 或LDL）的脂质谱。胆固醇和鞘磷脂生物合成，抑制了细胞中的病毒RNA 复制，HCV 诱导宿主细胞脂代谢的复杂重构，增强了病毒复制和子代的产生，发现降低胆固醇的药物（如他汀类药物）有助于治疗的成功。Phuyal 等[14]对人肺细胞长期暴露于多壁碳纳米管的影响及其对细胞蛋白和脂质的影响进行了研究，利用散弹枪脂质组学分析显示多种脂类的积累，表明长期暴露于低剂量的多壁碳纳米管会改变上皮靶细胞的蛋白质组和脂质组谱。Hu 等[15]利用散弹枪脂质组学揭示了SLE 患者脂质种类的变化，表明线粒体是七氟醚长时间暴露的主要靶点，导致氧化应激的增加和脂质稳态的改变。Gao等[16]应用改良的MS/MSALLDIAPtd2Gro 散弹枪脂质组学方法来量化小鼠各种组织中的Ptd2Gro 分子物种，为生物样品中Ptd2Gro（心磷脂）分子种类的定量提供了一种有效和准确的方法，MS/MSALL 方法采用1m/z的隔离窗口来选择分子离子，既可收集前体离子的所有片段，又可维持前体与片段之间的连接。Wang 等[17]使用基于多维质谱的散弹枪脂质组学方法，在正离子模式下通过162 Da 的中性丢失扫描，对大鼠脊髓样本中的脑苷类进行分析，显示出一簇未知的离子峰。为鉴定这些未知离子峰的结构特征，采用高质量分辨质谱对这些离子进行了质谱2 和质谱3 分析。大量的证据确定，这些未知的离子峰是单己基烷基酰基甘油（HAAG），包括它们的sn 位置异构体和烷基酰基组成异构体。同时，应用开发的方法来鉴定和量化存在于各种小鼠神经组织中的HAAG 物种。实现了首次对哺乳动物神经组织样本中HAAG 物种的脂质组学研究，为今后未知领域的生物学研究奠定了基础。

散弹枪脂质组学一直应用于植物机体脂类差异鉴定，由于其简单快速，可为油脂品种鉴定、食用油保真度和掺假鉴定提供技术支持。Tomás Rezanka 等[18]使用散弹枪脂质组学方法，分析解释了花生四烯酸含量的微小差异；研究发现一些分子物种，尤其是含有花生四烯酸的分子，在丰度上存在显著差异。基于散弹枪脂质组学方法，Xin 等[19]建立了一种快速识别菜籽油中tag、dag、MAGs 和FFAs 的新型脂质谱分析方法；发现油脂的主要差异不是来自于菜籽的类型，而是与品种直接相关。TAG 分子种类的定性和定量检测，可为植物生长发育过程中脂质代谢调控机制的研究提供支持。

2.2 质谱法脂质组学

质谱法是目前脂质组学分析最常用的检测方法，具有高通量和灵敏度高的特点，在应用中色谱技术与质谱联用，不仅有助于分离脂质化合物，也具有降低基质干扰的作用[20]。与散弹枪脂质组学相比，基于色谱分离的质谱方法需要更多的内部标准[21]。色谱分离导致内标物和分析物的差异洗脱，而分析物与标准物的共洗脱对补偿基质效应和梯度洗脱过程中不同的电离效率非常重要。

基于色谱分离质谱联用技术的色谱分离原理的不同，可分为气相色谱质谱联用技术（GC-MS）和液相色谱质谱联用技术（LC-MS）[22]。

2.2.1 气相色谱-质谱联用法（GC-MS）。GC-MS 是一种精密度高、灵敏度高和稳定性强的分析技术[23]。通常对易气化的小分子化合物进行分析，分子量通常小于300Da，而对部分热不稳定或不挥发的物质则需进行衍生化处理[24]，如糖类、氨基酸等，以增加样品的挥发性。GC-MS 峰容量高，重现性良好，以及有标准的数据库，可用于代谢物检索，如NIST 数据库（https://www.nist.gov/）[25]。GC-MS 技术在代谢组学中早有应用，目前在脂质组学中应用增多[26]。

大多数该类化合物在正离子模式下的质谱响应好于负离子，高能碰撞下逐步失去CO（相对分子质量28），且伴随CO2（相对分子质量44）的丢失；苯环上的CH3、CH3O等取代基也易形成碎片离子；此外，蒽醌苷类化合物则易发生苷键断裂而失去糖苷配基[33]。本品中共鉴定出10种醌类化合物，分别为丹参酮IIB、丹参新醌A、羟基丹参酮IIA、1-β-羟基隐丹参酮、大黄素、二氢丹参酮I、丹参酮V、丹参隐螺内酯、隐丹参酮和丹参酮IIA。

GC-MS 的不足之处在于，需要对样品中的分析物进行化学衍生化以降低样品的极性，使其在低极性色谱柱中更易分离。在这个过程中需要耗费一定时间，在衍生化过程中容易引起潜在分解，不仅导致“多起源和多峰现象”，而且会导致色谱图像异常，出现难以准确辨别和解释的情况[27]。

它在药物含量测定及医疗方向也有所应用。陈轶嘉等[28]研究证明，无催化剂作用的衍生化GC-MS 法专属性强，耐受性强，准确且灵敏，可用于利伐沙班原料药中基因毒杂质5-氯-2-酰氯噻吩的检测和质量控制。王淋等[29]研究也证明，GC-MS 简便、准确、灵敏，对于毒性物质S-环氧氯丙烷含量检测中发现空白溶剂与左卡尼汀均不干扰，充分说明该方法在左卡尼汀原料药遗传毒性杂质的检测中发挥重要作用。Fang 等[30]采用基于伪靶向GC-MS 代谢组学方法对78 例HCC患者的血清谱进行分析，通过一种新的基于网络的方法来识别具有鉴别能力的重要代谢特征，旨在建立基于血清代谢组学数据的预后模型，并可评估术后5 年内肝癌的预后风险。

由于GC-MS 技术易分离、检测准确且灵敏，在食品安全和有害物的检测等方面有所帮助[31]。Li 等[32]采用固相萃取和微萃取结合GC/MS（SPME-GC-MS）技术，对‘昌平8 号’苹果果实中的主要香气成分进行了检测；结果鉴定出29 种化合物，主要为醇类、酯类、醛类等，主要香气成分为乙酸、己基酯、丁基酯、（E）-2-己烯醛、1-丁醇、己醛和1-己醇。张嵘等[33]采用GC-MS 技术测定出韭菜中腐霉利的含量，并对各不确定性分量来源建立了数学模型，通过进一步分析，可为食物的安全性提供保障。常瑞红等[34]通过使用气相色谱-质谱联用结合双内标（D4-DBP，D4-DEHP）定量技术，对白酒中18 种邻苯二甲酸酯（PAEs）进行直接检测，结果表明该方法操作简单准确，重现性好，可适于白酒中各脂类代谢物的检测。袁蕊[35]测定了市售植物油中氯丙醇酯的含量指标，检测结果与使用FAPAS质控样品T2642QC 测定结果均在标准范围之内，表明该方法符合植物油中氯丙醇酯检测的要求，可进一步应用。

GC-MS 技术也用于检测农药残留。朱正伟等[36]利用气相色谱-串联质谱和气相色谱-四极杆-飞行时间质谱相互联动技术，通过对11 类常食用的蔬菜进行农药残留的快速筛查确证研究，发现分析保护剂可改善农药峰形并提高灵敏度，在农药定性分析方面有很大帮助；通过农药检出率可确定重点关注的农药清单，为蔬菜质量安全把控及抽样检测项目实施提供了理论依据和实践基础。王家磊等[37]建立QuEChERS-三重四极杆气相色谱质谱联用仪法测定茶叶中的31 种农药残留的分析方法，同时采用红茶和绿茶作为基质本底，用加标回收评价该方法的精密度和重现性，31种农药的平均回收率31%～86.7%，相对标准偏差0～10%；结果表明该方法符合茶叶中农药残留测定的技术要求，不仅操作简便快捷，而且灵敏度高、检测成本较低。Nozal 等[38]通过气相色谱-质谱联用技术分析了3 年来收集的不同来源的基础值，以检测7 种杀螨剂（阿特拉津、毒死蜱、氯苯磷、α-硫丹、溴丙酸、库马磷、氟戊酸）的残留；结果表明大部分分析的薄片（90%）含有至少一种这些化合物的残留，库马磷和氟戊酸钠残留量最多，其次是毒死蜱和氯芬虫磷。

它在化妆品化学成分测定上有所应用。邻苯二甲酸酯类化合物不确定度的主要来源有标准溶液、样品、样品处理过程中引入的不确定度。袁月等[39]以邻苯二甲酸丁苄酯（BBP）为例，通过GC-MS 技术对各不确定度分量进行了测定和评定，并计算了化妆品中BBP 合成不确定度和扩展不确定度。黄晓德等[40]采用水蒸气蒸馏法和气相色谱-质谱联用法（GC-MS）对红胡椒精油进行了提取分析，结果表明红胡椒精油含量为（5.42±0.15）%，通过GC-MS 分离检测到离子流峰126 个，经NIST11.L 标准谱库检索确认了59 种化学成分，确认59 种成分占精油总成分的95.58%，红胡椒精油组分中含量最高的化学成分是D-柠檬烯（17.03%），其后依次为α-水芹烯、（+）-3-蒈烯、α-蒎烯、榄香醇和表姜烯酮，这6 种组分共占了全部被检出组分的55.73%，初步确定为红胡椒精油的主要化学成分。

基于LC-MS 技术，包括选择性离子提取（SIE）、SRM/MRM 和数据相关分析。SIE 方法通常用于“全局”脂质分析，在柱洗脱过程中连续获得质谱，并在色谱分离后从获得的数据阵列中提取感兴趣的离子；在定量检测过程中，干扰物比较多，一般选择SRM；如果干扰物比较多，定量下限较小，MRM 可用于多个化合物同时检测[43]。数据分析在于重点阐明所检测到的脂离子结构，以及获取光谱。由于数据采集的局限性和有限的占空比及其他考虑因素，该方法中的产品离子分析通常仅限于有限数量的丰富离子。因此，这些方法适用于大部分液相色谱柱（如正相、反相、离子交换、疏水等，只要在洗脱条件下就可用质谱联用仪进行分析）。正相和反相HPLC-MS 也被用于鉴定和定量细胞鞘脂组的类别和单个分子物种，可方便地富集碱水解，然后固相萃取。高效液相色谱法结合紫外检测法，只适用于分析相对丰度较高的代谢物[10]。

LC-MS 技术在众多疾病研究中广泛应用，在医学发展中作出重大贡献。张英丰等[44]使用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用仪，在缺血性脑卒中的大鼠脑的脂质组分析中，发现丹参川芎冻干物对大鼠的脑缺血损伤具有修复作用，OPLS-DA 模型显示MCAO 模型大鼠与正常组的差异脂质代谢物差异显著，经丹参川芎冻干物干扰后，各实验组与正常组脑内整体脂质代谢趋于正常状态。Nair 等[45]将LC-MS/MS方法成功应用于小鼠药代动力学和脑微透析研究，表征了脑细胞外液和血浆中未结合的JQ1 暴露，表明该方法在脑类疾病研究中灵敏可靠。

陈龙等[46]利用LC-MS 技术，对CCl4诱导的急性肝损伤大鼠血清样本中脂类化合物的变化进行分析，并揭示了CCl4致肝损伤的机制，为脂质组学在肝损伤代谢机制的研究应用提供了思路和见解。纪建建等[47]通过高分辨率质谱分析方法，发现被RSV 感染的小鼠肺部细胞血清中存在多种脂质代谢物代谢紊乱，并证明金欣口服液不仅可改善小鼠肺炎症状，而且可恢复血清中异常紊乱的脂质变化。朱黎霞等[48]利用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱联用仪，发现痰瘀互结型冠心病患者与健康志愿者的尿液脂质组学差异显著，并鉴别了尿液中13 种差异脂质代谢物。叶凤英等[49]基于UHPLC/SFC-MS2技术，发现BPA 和BPS在不同剂量作用下均可引起细胞脂质组的全面紊乱，表明BPA 和BPS在平衡机体能量变化和促进胰岛素作用方面有显著影响。

3 总结与展望

脂质组学分析方法中，应用较多的主要是散弹枪脂质组学和基于色谱分离的质谱方法；散弹枪脂质组学可直接从提取物中进行脂类的鉴定和定量，在植物的小样本油中可进行脂质的简单快速鉴定，无需复杂预处理。质谱法多与色谱技术联用，已成为脂质分析中常用技术；GC-MS 专属性强，耐受性好，通过对植物中化学成分的测定，在食品安全以及农药残留方面也作出贡献，同时也应用于化妆品化学成分的安全测定，可见，未来GC-MS 的应用领域将更加广阔。LC-MS 无需衍生化即可分析难挥发或热稳定性差的代谢物的优点，在脂质组学分析中作出突出贡献；UPLC-MS 的代谢组学技术应用领域较多，可实现更快速的分离和更高的灵敏度。

脂质组学，通过对机体内脂类的动态变化研究，确定差异脂质化合物并追踪关键调控基因，揭示脂质在生物体中的作用机理。随着脂质组学分析技术的逐步发展，以质谱技术及色谱质谱联用技术的应用愈加广泛，脂质组学的研究将向前迈进一大步。未来脂质组学分析技术，不仅在植物生长发育、神经信号传导等方面广泛应用，也将会推动医学、食品安全、化妆品研发等多领域的研究进展。脂质组学与蛋白质组学、基因组学等多组学的有效结合，也将为微生物多样性及其代谢途径提供新的视角。