莫 芹，蒋 玮，陈一帆，吕贝贝

（上海市农业科学院生物技术研究所/上海市农业遗传育种重点实验室，上海 201106）

病原真菌是一类自然界无处不在的微生物，能够引起多种农作物的真菌病害，是影响农作物产量和品质的主要危害之一。据统计，目前植物病原真菌和类真菌的卵菌能够造成全球多年生作物20%的产量损失以及果蔬高达25%的采后损失[1,2]。另外，曲霉属、青霉菌属和镰刀菌属的真菌也会造成谷物和食品的真菌毒素污染，甚至威胁动物和人类的健康[3]。针对病原真菌的防控策略有杀真菌农药的使用、抗性品种培育、栽培管理和生物防控等，目前农业生产上真菌病害的防治主要还是依赖于化学农药，这也带来了生态环境安全和病害抗药性等难题，因此开发新的环境友好型防控策略逐渐受到研究人员的重视。

基于RNA干扰技术（RNA interference，RNAi）开发的生物农药被认为是极具潜力的新型植物保护产品，该技术在广泛调节植物的基因表达和病虫害防治上有很大的应用潜力[4]。RNAi技术是一种真核生物天然存在的保守的细胞免疫机制，它由双链RNA（double stranded RNA，dsRNA）和小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）介导，能够导致mRNA的降解和转录的弱化。目前，RNAi技术的应用大多是基于重组病毒载体和转基因植物载体两种策略开发的，这两种策略分别被称作为病毒诱导基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）[5]和宿主诱导基因沉默（host-induced gene silencing，HIGS）[6]。2017年美国孟山都公司推出HIGS开发的转基因玉米SmartStax Pro品种，目前已经在美国和加拿大获得了商业化种植的批准[7]。然而，由于多国政府对转基因作物的监管非常严格，使得转基因作物商业化成本较高，且部分国家消费者对转基因产品的接受程度较低。为了提高RNAi产品的实用性，研究人员采用一种新的非转基因RNAi策略开发植物保护产品，即喷雾诱导基因沉默（spray induced gene silencing，SIGS)技术。该技术不是通过重组病毒或者转基因植物的方式，而是通过外源施用dsRNA或siRNA的方式来控制植物内源基因或者病原体的靶标基因的表达[8]。基于 SIGS技术开发的新型生物农药具有效率高、目标特异性强、对环境友好等特点，是植物病虫害防控上强有力的工具[9]。

目前，SIGS技术已经被报道能够有效防治核盘菌Sclerotinia sclerotiorum、葡萄孢菌Botrytis cinerea、禾谷镰刀菌Fusarium graminearum等农业上重要的病原真菌[10]。本文主要针对真菌RNAi机制、SIGS技术原理及其在真菌病害防控上的研究进展进行综述，以期为基于SIGS开发防治病原真菌的新型生物农药提供一定的研究基础。

1 SIGS技术的原理

1.1 真菌RNAi机制

RNAi机制是真核生物的一种保守机制，早在1992年粗糙脉孢菌Neurospora crassa的研究中已经发现一种由重复转基因诱导的 RNAi现象（被称为 quelling），但其机制的解析是在模式动物线虫、果蝇等研究中完成[11]。与动物模型相似，真菌RNAi机制首先由Dicer蛋白切割dsRNA得到大量siRNA来引发RNAi机制，这些siRNA被装载到RNA诱导沉默复合体（RNA induced silencing complex，RISC）中，使得mRNA被 Ago蛋白降解，从而沉默靶标基因的表达。另外，在真菌中还存在由 RNA依赖型 RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）介导的循环机制，RdRP能够从特定的单链RNA（ssRNA）或目标mRNA产生dsRNA，进一步激活或放大沉默反应[12]，这也是RNAi技术在植物保护中应用效率高、潜力大的原因之一。

尽管沉默机制相似，但目前研究发现在不同宿主中RNAi的生理功能有所不同，而且仍存在一些功能尚未被报道。真菌RNAi具有很广泛的生物学功能，包括控制转座子活性、参与病毒防御、调控内源性基因、介导异染色质的形成、调节毒性和抗药性，以及适应环境压力条件等[13]。根据生理功能的需要，目前在真菌中主要发现两种RNAi途径：一种为经典的依赖Dicer的RNAi途径，在丝状真菌粗糙脉孢菌N.crassa和裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe等模式系统中已有大量研究[14]；另一种为在卷枝毛霉Mucor circinelloides中发现的非经典 RNAi 途径（Non-Canonical RNAi Pathway，NCRIP），该途径依赖于RdRP和新型核糖核酸酶Ⅲ类似物R3B2，主要在调节毒力和转座子迁移方面发挥重要作用[15]。

完整的RNAi机制是SIGS成功控制病原真菌的前提，大多数真菌都具有RNAi机制的重要组分，包括Dicer蛋白、Ago蛋白和RdRP。然而，在进化过程中有些真菌也丢失了RNAi机制中的一些关键组分，例如酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae基因组丢失了Ago1和Dcr1蛋白编码基因[16]；玉米黑粉菌Ustilago maydis基因组丢失了Ago1、RdRP1-3和Dcr1蛋白编码基因[17]；以及真菌类隐球菌Crytpococcus deuterogatti基因组分别丢失了Ago1、Ago2、Dcr1和RdRp1蛋白编码基因[18]。RNAi机制在真菌进化过程中起着非常重要的作用。有学者认为在进化过程中RNAi机制可能对一些真菌的生存不利，它们在丢失RNAi机制重要组分的同时可能进化出比RNAi更有利生存的其他防御机制[18]。

1.2 SIGS原理

随着RNAi机制的逐步研究，以及HIGS和VIGS技术在植物害虫、线虫、病毒、真菌等病虫害防控上的成功应用，该技术也逐渐被科学家认可为一种非常有潜力的新型植物保护技术[19]。2016年，加州大学的Wang和Jin[20]研究发现在植物表面喷洒靶向病原体关键基因的dsRNAs或siRNAs可以有效地保护作物免受病原菌的侵害，他们将这种策略称之为SIGS技术。SIGS技术是通过非转基因方式将dsRNA传递到植物和病原菌中的，是RNAi技术在植物保护领域，继VIGS和HIGS策略之后的应用补充。该技术的原理为：将以病原体关键基因为靶标的dsRNA和/或siRNA喷洒到植物表面，再通过两种可能的途径来沉默病原体关键基因。第一种途径是真菌病原体直接摄取RNA分子进而诱导真菌的RNAi。另一种途径为宿主植物首先摄取RNA分子, dsRNA被植物DCL蛋白切割成siRNA。未剪切的dsRNA和siRNA在真菌侵染过程中被转移到真菌细胞中，从而诱导真菌的RNAi。两种情况最后均能降解真菌病原体的mRNA以抵消病原体的毒性或导致病原体死亡（图 1）。一般地，要实现 SIGS技术进行真菌病害防控的目的需要具备两个基本条件：一是病原真菌能够从环境或寄主中摄取dsRNA，该现象被称为环境RNAi（environmental RNAi，eRNAi）或跨界RNAi（cross-kingdom RNAi，cRNAi）；二是病原真菌具有完整的RNAi机制，使得摄取的dsRNA能够沉默关键基因的表达。

图1 喷雾诱导基因沉默（SIGS）技术保护作物对抗真菌病原体Fig.1 Spray-induced gene silencing (SIGS) for crop protection against fungal pathogens

1.3 真菌环境RNAi、系统性RNAi和跨界RNAi机制

自1986年Fire和Mello在模式动物秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans的研究中提出RNAi的概念[21]，后续研究发现线虫也能够通过取食和浸泡获得环境中的dsRNA，并且诱发细胞RNAi，他们将这种因环境中的dsRNA而诱发的序列特异基因沉默称之为eRNAi；而RNAi效应能够扩散到起初没有接触到dsRNA的细胞和组织中的现象也被称为系统性RNAi（systemic RNAi，sRNAi）[22]。eRNAi和sRNAi是大多数动植物的普遍现象，与模式线虫和拟南芥相比，真菌的eRNAi和sRNAi机制目前研究仍然较少[23]。基因组测序分析等工具研究发现真菌基因组中没有编码SID蛋白（一种与线虫dsRNA摄取相关的关键蛋白）的同源基因，因此真菌很可能依赖于胞吞作用来促进dsRNA的摄取[24,25]。2016年Wang等[26]研究发现葡萄孢菌B.cinerea能够吸收荧光标记的dsRNA，这是真菌eRNAi的首次报道，但他们没有解析其吸收机理。Wytinck等[27]利用活细胞成像、转基因真菌培养和内吞抑制剂添加等方式确定了真菌菌核病菌S.sclerotiorum的摄取机制是通过网格蛋白介导的内吞作用发生的。虽然没有识别dsRNA的受体蛋白，但通过RNAi介导的敲除试验发现，一些网格蛋白、膜结合蛋白、以及促进内源性囊泡形成和真菌出芽过程中的蛋白参与了 dsRNA的摄取和加工。此外，胞吞作用对丝状真菌的生长繁殖和致病性均有重要作用，一些病原真菌可能通过调节受体的内吞作用从而影响其对植物的致病性[27]。

即使真菌细胞具有完整的RNAi组分，eRNAi或sRNAi功能的缺失也会影响SIGS的基因沉默效果，如叶枯病菌Zymoseptoria tritici也具有完整的RNAi核心组分，但仍对dsRNA不敏感[28]；质粒介导的dsRNA不能引发白根腐菌Rosellinia necatrix的sRNAi从而不能利用SIGS技术达到很好的根腐病防治效果[29]。真菌对dsRNA的吸收能力是SIGS防控成功与否的关键，不同种属的病原真菌对dsRNA的吸收能力不同，最近的一项研究发现，植物病原真菌灰霉病菌B.cinerea、菌核病菌S.sclerotiorum、番茄丝核病菌Rhizoctonia solani、黑曲霉Aspergillus niger和大丽轮枝病菌Verticillium dahliae能够有效吸收 dsRNA，但炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides不能吸收，而在一种有益真菌绿木霉Trichoderma virens中吸收较弱。局部利用靶向致病菌毒力相关基因的dsRNA进行的SIGS试验结果表明，SIGS的成功与否很大程度上取决于病原体对RNA的吸收效率[10]。

植物叶片主要通过气孔和表面伤口吸收dsRNA，但叶片表面存在阻碍吸收的疏水性角质层和核酸降解酶，因此植物叶片对dsRNA分子的吸收是极其微量的，这也给SIGS技术在植物保护领域的应用带来了很大的挑战[30]，病原真菌在侵染植物时造成的伤口可能会辅助植物对 RNA的吸收。植物细胞能够通过其RNAi机制将吸收长链的dsRNA加工为21-24 nt的siRNA，并且利用胞间连丝和韧皮部使其在细胞之间进行长距离运输[31]。另外，大量试验证明，植物与真菌之间也存在双向RNA分子的传递现象，这种在不同物种间传递的基因沉默被称为 cRNAi[32-34]。病原真菌在进化过程中产生了类似于效应子功能的小 RNA，跨界进入寄主植物调控植物的防卫反应，从而帮助病菌侵染和定殖，增加致病性。例如灰霉病菌可以产生多种小RNA（Bc-siR3.1、Bc-siR3.2、Bc-siR5和Bc-siR37）来抑制宿主植物的免疫相关基因[35]；小麦条锈菌能产生Pst-milR1通过cRNAi的方式靶定到寄主小麦的重要抗病基因病程相关蛋白2（pathogenesis related proteins 2，PR2）[36]。对应地，转基因植物产生的dsRNA或siRNA也能进入真菌影响真菌生长和致病力，起到保护植物的作用。目前以HIGS技术获得的转基因株系能够有效保护植物防控多种病原真菌和卵菌，如小麦白粉病菌Blumeria graminis[37]、小麦叶锈菌Puccinia triticinia[38]、镰刀菌属Fusariumspp.[39]、致病疫霉Phytophthora infestans[40]、辣椒疫霉Phytophthora capsici[41]等。可以说cRNAi是HIGS技术在真菌病害防控研究的主要理论依据。但对于SIGS技术来说，真菌通过cRNAi方式摄取靶标dsRNA或siRNA需要依赖植物对外源dsRNA的吸收效率和RdRP介导的沉默信号放大效应，只有积累足够的siRNA形成系统性，再被真菌摄取后才能有效控制病原。而且，在这个过程中 dsRNA也随时会被细胞内外的核酸酶降解。

2 SIGS技术在植物真菌病害防治中的研究进展

目前，SIGS技术对真菌病害的防治研究对象主要有引起枯萎病的镰刀菌属、引起作物和采后果蔬花卉灰霉病的葡萄孢菌、引起茎腐病的菌核病菌、以及一些其他重要病原真菌，详见表1。早在2013年Francis等[42]就测定了体外合成 dsRNA对两种主要病原真菌—尖孢镰刀菌F.oxysporum和黑条叶斑病菌Mycosphaerella fijiensis孢子萌发的影响，筛选获得了有效抑制香蕉黑斑病和枯萎病的潜在靶点，但当时筛选到的靶点仍然以HIGS技术获得转基因香蕉株系进行抗病能力测试。直到2016年SIGS才被证明是一种防控谷物致病菌禾谷镰刀菌的有效方法。Koch等[43]将同时靶向 3个麦角甾醇生物合成基因（CYP51A、CYP51B和CYP51C）的dsRNA喷施到大麦叶片后可以有效地降低3个靶标mRNA的合成，并显著降低镰刀菌在寄主植物上的生长。随后该团队利用生物信息学工具优化了 dsRNA靶标的设计来提高其沉默效率，从而进一步提高SIGS的抗病效率[44]。2020年，Koch团队比较了人工设计和计算机工具设计的dsRNA的沉默效率，他们发现靶向真菌RNAi机制的关键组分（Ago和Dicer蛋白）可以保护大麦叶片免受禾谷镰刀菌感染，而且试验证明基于人工设计的 dsRNA具有更高的基因沉默效率。此外，靶向生长关键蛋白（微管蛋白和肌球蛋白）的dsRNA能够抑制禾谷镰刀菌的生长，减轻中国南方小麦赤霉病的病害程度[45]。最近的一项研究表明靶向尖孢镰刀菌生长关键因子（CYP51、Chs1和EF2）的dsRNA以叶面喷雾、叶柄吸附和蘸根方式均能显著控制病原毒性[46]。

表1 SIGS技术在真菌病害防治中的研究进展Table 1 Research progress on SIGS in the control of fungal pathogens

第二个 SIGS主要研究对象是引起水果、蔬菜和花卉采前/后灰霉病的葡萄孢菌。Wang等[26]研究发现在水果、蔬菜和花卉表面喷施靶向DCL1和DCL2的dsRNA能够有效抑制病原毒性，与对照相比，接种到水果和蔬菜表面的病灶大小显著降低。Austein等[47]利用 RNA测序技术和生物信息学分析来指导dsRNA靶标的设计，并获得了有效防治葡萄孢菌侵害的多个有效靶标。在dsRNA传递方式的改良上，Nerva等[48]证明以高压喷涂叶片和茎吸收的方式比普通叶片喷施方式对葡萄灰霉病的防治效果更好。

此外，SIGS技术在其他重要病原防治上也有大量报道，例如靶向囊泡运输途径相关基因（VPS51+DCTN1+SAC1）的dsRNA能够有效降低多种病原真菌的病害程度，包括黑曲霉A.niger、丝核病菌R.solani、大丽轮枝病菌V.dahliae等[10]；体外施用靶向几丁质酶编码基因的siRNA能够抑制菜豆壳球孢菌Macrophomina phaseolina的菌丝生长[49]；体外合成靶向致病疫霉P.infestans的dsRNA分子能够有效防治马铃薯晚疫病[50]；向大豆叶面直接喷施靶向乙酰辅酶A酰基转移酶、甘氨酸裂解系统H蛋白和核糖体S16蛋白的dsRNA均能够减少大豆锈菌Phakopsora pachyrhizi的锈斑数量和病菌量，进而有效防控大豆锈病的发生[53]。以上这些试验成功案例表明SIGS技术可以为开发一种保护植物免受真菌病害的新工具。

3 SIGS技术的潜力与挑战

RNAi技术在真菌病害防治中的研究多以HIGS技术进行，目前已经发现HIGS技术能够为烟草、棉花、香蕉、大麦和小麦等多种作物提供了有效的保护[54]。虽然HIGS技术可以为这些植物提供系统水平的抗性，但大多数作物品种缺乏成熟的转化方法，以及公众对转基因产品的接受度可能会限制其在商业作物中的应用。SIGS技术采用一种更通用的dsRNA传递策略，可以应用于任何植物，以该技术开发的新型核酸农药也是替代传统农药的可行性方案之一。就防治效率来说，HIGS和SIGS因不同的dsRNA设计和不同的目标病原可能各有优劣。研究证明，在实验室条件下长度为200～500 nt的dsRNA-CYP51以SIGS技术防治禾谷镰刀菌的效率比 HIGS高 30%左右，而随着其长度的进一步增加，两者的防控效率差异趋平[44]。Hu等[53]研究发现HIGS和SIGS均能有效防控大豆锈病的发生。

SIGS作为绿色防控技术在农业可持续发展方面具有很大的优势，与化学农药相比，具有环境残留少、抗药性发生率低等优点。目前，国内外基于SIGS的RNA生物农药的开发仍处于实验室研究阶段，仍然面临很多挑战。首先，真菌SIGS机制尚未完全清晰阐明。不同病原真菌的RNAi机制和dsRNA摄取机制存在进化上的差异，且 dsRNA进入植物细胞产生表观遗传效应也需要进一步研究，因此分子靶标的设计需要进一步通过生物信息学和遗传学工具的辅助，例如小RNA测序技术可能是解析真菌发病和SIGS机制与过程的有效工具，能够帮助设计有效防控病原真菌的分子靶标。其次，dsRNA的合成成本和递送效率可能是限制其商业化应用的主要原因。目前用于真菌防控研究的dsRNA分子多以酶合成（MEGA script®RNAi kit）的方法进行制备，但该方法价格高昂不适合田间大规模应用。利用微生物工程菌合成的方法可能是降低dsRNA制备成本的可行性方案，目前大肠杆菌Escherichia coli、酿酒酵母S.cerevisiae和芽胞杆菌Bacillusspp.等多种工程菌被用来大规模合成dsRNA分子，而dsRNA的成本也从2008年的约1.2万美元/g，降至2020年的0.5美元/g[55]。此外，dsRNA的递送技术也在不断更新，高压喷施、茎秆注射、蘸根等方式被证明能提高dsRNA递送效率[56,57]，通过纳米材料包埋等方式也能将dsRNA的防治效果延长到30 d左右[58]，但这些方式和材料在开发时也需要考虑成本和可操作性的问题。最后，SIGS技术从实验室进入到田间应用也需要提高脱靶预测的准确性和可控性，以便进行充分的风险评估。尽管该技术具有较高的序列特异性，但长dsRNA产生的siRNA仍然有脱靶结合的风险。目前在美国和欧盟的农药和植物保护产品监管框架中，还没有针对RNA喷剂相关植物保护产品的具体数据要求[59]。而欧洲食品安全局（EFSA）的一项风险评估也将RNA生物农药分类为安全的，其评价依据为可喷洒的RNA对动物/人类构成的风险很低[60]。Koch等[61]认为RNA生物农药（如孟山都和拜耳公司的BioDirectTM技术）进入市场只是时间问题，因此我国的RNA生物农药的环境风险评估也需要加强，以促进其未来的市场定位，同时也需要尽早开展教育工作和宣传活动，促进公众对该技术和产品的认识和理解。