王珊珊，田俊策*，鲁艳辉，徐红星，王香萍*，吕仲贤*

（1.农林病虫害预警与调控湖北省工程中心，长江大学，荆州 434025；2.浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所/农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室，杭州 310021）

稻螟赤眼蜂Trichogramma japonicum隶属于膜翅目Hymenoptera，赤眼蜂科Trichogrammatidae[1]。稻螟赤眼蜂是稻田赤眼蜂的优势种群，其对稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis、二化螟Chilo suppressalis等水稻鳞翅目害虫具有良好的防治效果[2,3]。近年来，由于二化螟等水稻鳞翅目害虫的抗药性问题日益突出以及绿色防控技术的持续推广，淹没式释放稻螟赤眼蜂防治水稻鳞翅目害虫的应用面积在日益增长中。随着稻螟赤眼蜂生物防治应用的扩大，对其繁育、滞育、农药抗性等分子机制方面的研究也逐渐增多。

实时荧光定量PCR技术被广泛应用于分子生物学基因表达定量方面的研究。qRT-PCR是在普通PCR的基础上引入荧光基团，通过相应的荧光信号积聚实时监测整个反应的进程，为未知序列进行定量分析的方法，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确等优点[4,5]。在实际应用中，众多因素的不稳定会对试验结果造成直接影响，如RNA提取、cDNA合成及PCR扩增效率等。为了降低各因素对其结果的影响，需要对靶基因的结果进行标准化处理，而内参基因是校正样本间的差异、对靶基因进行标准化处理的关键因素。同时，为减少样品之间和样品内部的误差，常用表达稳定的内参基因进行校正和标准化，因此选择合适的内参基因对其结果的准确性至关重要[6-8]。常用于定量试验的内参基因有肌动蛋白基因（Actin）、多聚泛素酶基因（Ubiquitin，UBQ）、微管蛋白基因（Tubulin，TUB）、转录延伸因子（EF1a）和泛素结合酶基因（Ubiquitin-conjugating enzyme，UBC）等管家基因[9]。研究表明，内参基因不存在绝对通用性，未经筛选的内参基因进行校正处理可能使结果不准确，甚至是错误的[10]。因此，基于不同的物种、样本材料、发育阶段和试验条件来筛选出稳定表达的内参基因至关重要。

本研究共挑选了10个潜在的内参基因，包括6种常用作为内参基因的基因ACTR2、ARPC2、EF1a、EEF1D、HSP70和GAPDH以及从热刺激处理稻螟赤眼蜂转录组中挑选的4种稳定表达基因TMEM209、PABPC1L、SFRS7和CSNK1a1，探讨其在温度处理、食物处理、农药处理和不同发育历期下供试基因的表达稳定性，为不同试验条件下选择合适的稻螟赤眼蜂内参基因提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

试验所用米蛾Corcyra cephalonica卵饲养在相对湿度为75%±5%，温度为（26±1）℃的人工气候室。多代繁育的米蛾在60目的铁纱网上产卵后用软毛刷收集获得。将当天收集的新鲜米蛾卵粘附于有双面胶的纸片（长2 cm，宽1 cm）上制成米蛾卵卡，然后30 W紫外灯正下方30 cm处照射杀胚45 min，供繁蜂用。

稻螟赤眼蜂为杭州萧山稻田中采集被寄生的二化螟卵，室内鉴定纯化后，利用中间寄主米蛾卵培养获得，稻螟赤眼蜂种群用已灭活的米蛾卵在人工气候室内（温度25 ℃±1 ℃、相对湿度75%±5%、光周期14L∶10D）繁殖多代后用于试验。

1.2 试验分组及处理

1.2.1 温度处理 将羽化4 h的成蜂分别在高温40 ℃和低温0 ℃下刺激1 h后，放回25 ℃培养箱恢复1 h后收集样品，以一直在25 ℃培养箱（未受高温低温刺激）的稻螟赤眼蜂成蜂为对照。每个处理重复3次，以300头稻螟赤眼蜂为1个重复。取样后，液氮冷冻处理，-80 ℃保存直至RNA提取。

1.2.2 取食处理 将羽化4 h的成蜂分为3个处理，处理1不喂食任何食物作为对照，处理2提供清水，处理3提供10%的蔗糖水。任其取食4 h后，收集样品。每个处理重复3次，以300头稻螟赤眼蜂为1个重复。取样后，液氮冷冻处理，-80 ℃保存直至RNA提取。

1.2.3 不同农药处理 选择 2种稻田常用的防治褐飞虱的农药吡虫啉和吡蚜酮，将原药溶于丙酮，以1 mg/mL的浓度制备药膜管。将羽化4 h的成蜂引入药膜管中刺激1 h，放回培养箱恢复1 h后收集样品，以丙酮药膜管为阴性对照，以未引入药膜管的为空白对照组。每个处理重复3次，以300头稻螟赤眼蜂为1个重复。取样后，液氮冷冻处理，-80 ℃保存直至RNA提取。

1.2.4 不同发育历期样本 分别收集寄生5 d后的蛹期寄生蜂和羽化4 h的赤眼蜂成蜂，每个虫态重复取样3次，每个重复收集300头稻螟赤眼蜂。样品收集后，液氮冷冻处理，-80 ℃保存直至RNA提取。

1.3 总RNA的提取与cDNA的合成

利用TRIzol Reagent剂（北京宝盈同汇生物技术有限公司）对稻螟赤眼蜂样品分别提取RNA，具体步骤参照TRIzol试剂说明书。并通过琼脂糖凝胶电泳检测各样品的RNA质量，RNA电泳条带清晰完整，说明提取的RNA质量较好。进一步测得RNA OD260/OD280值，确定RNA的浓度及纯度。通过反转录试剂盒，合成cDNA，操作步骤参照Thermo Fisher反转录试剂盒说明书，合成的cDNA保存在-20 ℃冰箱备用。

1.4 qRT-PCR检测候选内参基因引物特异性和扩增效率

利用 Prime 3.0软件设计稻螟赤眼蜂的候选基因特异性引物（表 1）。实时荧光定量 PCR 反应使用Bio-Rad CFX96 real-time system，按照iTaqTMUniversal SYBR Green Supermix（Bio-Rad，USA）说明书进行。反应体系 20 μL，包含 cDNA 1 μL、上下游引物各 1 μL、iTaq Universal SYBR Green Supermix（2×）10 μL、ddH2O 7 μL。反应程序为95 ℃ 2 min，95 ℃ 5 s和60 ℃ 30 s循环40次。熔解曲线：60 ℃～95 ℃，每升高0.5 ℃收集一次荧光信号。每个cDNA样品设置2个技术重复。cDNA按5倍等比稀释成5个不同浓度，获得引物扩增效率。

1.5 数据统计与分析

qRT-PCR反应结束后，根据仪器自带的软件进行数据分析，得到各个反应的Ct值。通过Delta-Ct、NormFinder、geNorm和BestKeeper四种方法对内参基因表达的稳定性进行评估。Delta-Ct是某内参基因相对于其他各内参基因ΔCt的标准差（SD）的平均值对内参基因表达稳定性进行排序，显示两种内参基因之间的表达差异[11]。基于基因的相对表达量（2-ΔCt），NormFinder是根据组内和组间的差异对参考基因进行排名[12]。GeNorm是对内参基因表达稳定值M值进行分析并排序，M值越小，基因表达稳定性越好[13]。内参基因的最佳数量通过geNorm计算的配对变异值Vn/（n＋1）确定。当变异值＜0.15时，内参基因的最佳数量为n，当其＞0.15时，应当选n＋1个内参基因做进一步校正。BestKeeper是通过计算各内参基因的标准差（SD）和变异系数（CV）对内参基因表达稳定性进行排序，SD和CV越小，内参基因的稳定性越好[14]。最后通过RefFinder（http://blooge.cn/RefFinder/?type=reference）软件对内参基因的稳定性进行综合性评价。

2 结果与分析

2.1 候选内参基因引物特异性分析及扩增效率检测

以cDNA为模板进行qRT-PCR分析各样品的熔解曲线，显示10个内参基因均呈现单一的信号峰（图1），同时将切胶回收的条带经测序比对后确定为靶标基因的特异性条带。对扩增效率进行计算，结果显示10个候选内参基因的扩增效率在96.70%～115.10%，相关系数R2在0.991～1.000（表1）。

表1 侯选基因引物信息Table 1 Primers for the candidate genes

图1 候选基因的熔解曲线Fig.1 Melting curves of the candidate genes

2.2 候选内参基因表达水平

CT值是PCR扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，它能反应内参基因的表达水平。CT值越大，表明基因的表达量越低。10个候选内参基因的CT值在14.65～24.02。其中PAPBC1L和EF1a的CT值显著低于其他基因（F＝306.4，P＜0.001），表明该基因的表达丰富度较高；而ACTR2的CT值要显著高于其他基因，表明该基因的表达丰富度为候选内参基因中最低（图2）。

图2 候选内参基因的CT值Fig.2 CT value of candidate reference genes

2.3 候选内参基因稳定性分析

2.3.1 温度对稻螟赤眼蜂候选内参基因表达稳定性的影响 在不同温度刺激下 Delta CT、NormFinder和GeNorm软件分析均表明，基因EF1a是最稳定的内参基因，而BestKeeper分析表明基因CSNK1a1是最稳定的内参基因，ACTR2和GAPDH两个内参基因在各分析软件中表达较不稳定（图3）。根据 RefFinder综合分析，在不同温度刺激下，10个候选内参基因的表达稳定性从高到低依次是EF1a＞EEF1D＞PABPC1L＞TMEM209＞SFRS7＞ARPC2＞CSNK1a1＞HSP70＞GAPDH＞ACTR2（表 2）。

表2 温度对候选内参基因稳定性的影响Table 2 Effect of temperature on the stability of candidate reference genes

2.3.2 取食对稻螟赤眼蜂内参基因表达稳定性的影响 不同的取食处理下，Delta CT、BestKeeper、NormFinder和GeNorm软件分析均表明GAPDH基因的稳定性是最低的，其次是ACTR2基因。ARPC2基因在BestKeeper和GeNorm软件分析中，表达最稳定；EF1a基因在NormFinder软件分析中，表达最稳定。与其他分析软件不同的是，GeNorm分析结果表明TMEM209基因的表达稳定性最好（表3）。利用RefFinder软件综合分析，结果表明10个内参基因表达稳定性从高到低依次是SFRS7＞ARPC2＞EF1a＞TMEM209＞CSNK1a1＞PABPC1L＞EEF1D＞HSP70＞ACTR2＞GAPDH。

表3 取食对候选内参基因表达稳定性的影响Table 3 Effect of feeding on the stability of gene expression of candidate reference genes

2.3.3 农药处理对稻螟赤眼蜂内参基因表达稳定性的影响 不同农药处理中，Delta CT、NormFinder软件分析均表明PABPC1L基因表达最稳定，ACTR2基因表达最不稳定。BestKeeper、GeNorm软件分析表明CSNK1a1基因表达最稳定，GAPDH基因表达不稳定。不同的农药处理下，利用RefFinder分析软件综合分析，发现 10个候选内参基因的表达稳定性从高到低依次是PABPC1L＞TMEM209＞CSNK1a1＞ARPC2＞EEF1D＞EF1a、SFRS7＞HSP70＞GAPDH＞ACTR2。综合分析，不同的农药刺激下，稻螟赤眼蜂10个候选内参基因中表达较为稳定的3个内参基因分别为PABPC1L、TMEM209和CSNK1a1（表4）。

表4 不同农药处理对候选内参基因表达稳定性的影响Table 4 Effects of different pesticide treatments on the stability of gene expression of candidate reference genes

2.3.4 发育历期对稻螟赤眼蜂内参基因表达稳定性的影响 在蛹期和成虫期收集的样品中，Delta CT和NormFinder分析软件结果表明PABPC1L基因表达最稳定；BestKeeper分析结果表明SFRS7基因表达最稳定；GeNorm分析ARPC2、EEF1D基因表达最稳定。TMEM209基因在各分析软件结果中，基因表达稳定性均较差。利用 RefFinder分析软件综合分析，10个候选内参基因的表达稳定性从高到低依次是PABPC1L＞ARPC2＞ACTR2＞EEF1D＞HSP70＞GAPDH＞SFRS7＞EF1a＞CSNK1a1＞TMEM209。综合分析，在不同的发育历期下，3个较为稳定的内参基因分别是PABPC1L、ARPC2和ACTR2（表5）。

表5 不同发育历期对候选内参基因表达稳定性的影响Table 5 Effects of different developmental stages on the stability of gene expression of candidate reference genes

2.4 内参基因配对变异值

MIQE指南指出，至少使用两个经过验证的内参基因对 qRT-PCR的结果进行标准化[16]。本研究利用GeNorm分析计算配对变异值Vn/（n＋1）确定合适的内参基因数量，当变异值小于0.15时，则不需要增加额外的内参基因来提高准确性[17]。在本研究四种条件下，变异值均小于0.15（图3），这表明2个内参基因已经足够保证准确性。

图3 稻螟赤眼蜂内参基因最优数量分析Fig.3 Determination of the optimal number of reference genes in Trichogramma japonicum

3 讨论

qRT-PCR技术具有高效、准确、灵敏和易重复等特点，现该技术已成为基因表达分析的主要技术手段之一，但是其结果的准确性是基于所选的表达稳定性较高的内参基因，未经验证而使用先前发表的内参基因可能会导致结果出现偏差[17,18]。目前随着稻螟赤眼蜂生物防治的再次被重视，对其生物分子的研究也越来越多。本研究通过Delta-Ct、NormFinder、geNorm和BestKeeper四种方法分别对温度处理、饲养条件处理、药剂处理以及不同的发育历期的稻螟赤眼蜂进行候选内参基因稳定性评估。四种方法计算得出10种候选内参基因的稳定性排名存在差异，最后通过RefFinder分析软件对该结果进行综合排序。

在本试验中，我们利用上述5种方法分别分析评估了PABPC1L、ACTR2、ARPC2、EF1a、EEF1D、SFRS7、HSP70、CSNK1a1、GAPDH和TMEM209这10种候选内参基因在4种不同试验条件下的稳定性。其中ACTR2、ARPC2、EF1a、EEF1D、HSP70和GAPDH这6种基因是已经报道在某些物种的研究中做为内参基因使用的基因。ARPC2和ACTR2是肌动蛋白相关复合体七个亚基其中之一[19]，肌动蛋白对于细胞的移动和收缩有着重要作用，在肌肉运动中也起重要作用。ARPC2最先是在棘阿米吧中发现，主要在组织的细胞质和细胞中表达[20]，参与细胞内肌肉蛋白聚合的控制，在微丝的核化中起关键作用[21,22]。该基因在沙漠蝗Schistocerca gregaria研究脑内基因表达时可作为内参基因[23]，而在本研究中在不同发育历期中表达较为稳定。延伸因子即EF1a和EEF1D，通过催化氨酰基转运RNA的依赖型GTP结合到核糖体的受体位点，在翻译过程中起着重要作用[24]。EF1在很多研究中，被认为是合适的内参基因，如斜纹夜蛾Spodoptera litura的温度处理样品[25]、东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis的不同发育历期[26]、西花蓟马Frankliniella occidentalis的不同历期和温度处理[27]、大螟Sesamia inferens的不同组织和不同发育历期[28]及瓢虫的不同发育时期和温度处理[29]等。如在鲑鱼[30]和直翅目[31,32]研究显示EF1表达也较稳定。与前人报道相似，本研究显示EF1a和EEF1D可在温度处理时做为内参基因。HSP基因家族是与热激相关的蛋白，在巴氏新小绥螨Neoseiulus barkeri的研究显示Hsp60和Hsp90在杀螨剂的刺激下是最稳定的内参基因[33]，但Hsp70并不适合做为内参基因，该结果与本研究一致，Hsp70在供试条件下均不适合做为内参基因。GAPDH在多个研究报道中显示可以做为内参基因使用，如在甜菜叶蛾Spodoptera exigua的不同发育历期[34]、温度胁迫下的黄翅娟野螟Diaphania caesalis[35]和不同光处理条件下的粘虫Mythimna separate[36]等。但也有不少物种与本研究的研究结果相似，GAPDH并不适合做为内参基因，如在二化螟不同发育历期、不同组织、温度处理、杀虫剂处理、取食不同饲料、取食不同水稻和 dsRNA处理均不适合做为内参基因[37]，在蜜蜂Frieseomelitta varia和Melipona quadrifasciata不同发育历期、性别、组织以及细菌注射和农药处理的条件下都不适合做为内参基因[38]。

虽然大部分的内参筛选研究一般都会选择已报道的内参基因做为候选基因，但也有研究通过筛选未报道的候选基因筛选到了更合适的内参基因。Xie等[39]在通过筛选发现了ZFP268可以做为螟黄赤眼蜂Trichogramma chilonis在不同食物和不同温度处理下的内参基因，而在此前并未有ZFP268可以做为内参基因的报道。在本试验中，除了选择了常用的看家基因作为候选内参基因外，我们还根据转录组数据选择了几种在热激条件下稳定表达但未报道做为内参基因的4种候选基因，包括TMEM209、PABPC1L、SFRS7和CSNK1a1，希望能从中筛选出合适的内参基因。结果显示，尽管CSNK1a1并不是合适的内参基因，但PABPC1L和TMEM209是农药处理下表达最稳定的基因，PABPC1L同时还是不同发育历期中表达最稳定的基因，而SFRS7则是取食不同食物后表达最为稳定的基因。因此，在本次研究中我们共筛选到了3种未曾报道过的内参基因，这也提示了我们在今后内参基因的筛选中可以适当地扩大筛选范围，从而发现一些更为合适的内参基因。

本研究中，我们利用了5种方法评估了10个候选内参基因在不同条件下的表达稳定性。其中温度处理下，EF1a基因表达最稳定；取食条件不同时，SFRS7基因表达最稳定；而在农药处理和不同发育历期时，PABPC1L基因表达最为稳定。因此，我们的试验表明没有通用的稳定表达的内参基因，不同的试验条件下应该选择适合该条件下的内参基因。本研究结果为在不同条件下选择稻螟赤眼蜂内参基因提供了参考，也有利于在稻螟赤眼蜂的基因表达研究中取得更为可靠、准确的数据。