郑远荣，腾军伟，刘振民

（乳业生物技术国家重点实验室，上海乳业生物工程技术研究中心，光明乳业股份有限公司乳业研究院，上海 200436）

干酪是一种新鲜或发酵乳制品，具有悠久的历史，全世界生产干酪的品种数以千计。其中，蓝纹干酪、卡门贝尔干酪和布里干酪等霉菌成熟干酪因其独特的风味和口感受到消费者的青睐[1-2]。制备霉菌成熟干酪时，国外常用的发酵剂有罗克福尔青霉、卡门培尔青霉和白地霉等[3-6]。在成熟过程中，霉菌成熟干酪的主要生化变化涉及蛋白水解、脂肪分解以及乳糖、乳酸和其他化合物的代谢[7-9]。但是，在这些常用的霉菌干酪发酵剂中，部分发酵剂会使蛋白质和脂肪深度水解，导致异味的产生，不符合部分消费者的期待。

红曲霉属是我国用于发酵食品生产的传统食用菌。许多研究表明，红曲霉的代谢产物中存在莫纳可林K、γ-氨基丁酸、红曲色素和其他生物活性化合物[10-16]。红曲霉属对食品中的成分具有良好的糖化、酯化和蛋白水解能力，长期在东亚用于生产发红曲米、腐乳、玫瑰香醋、米酒和其他食品[17-19]，在人类长期食用的驯化过程中，具有良好的安全性。红曲霉属在干酪的制作方面具有良好潜力，但该方面的研究目前相对较少。

因此，本研究采用红曲霉作为附属发酵剂，在软质干酪生产技术的基础上生产干酪，目的是研究红曲霉对干酪成熟过程中理化性质和风味的影响，为红曲霉在干酪中的应用提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原料牛乳由光明乳业股份有限公司乳业研究院乳业生物技术国家重点实验室提供。

红曲霉（Monascus） 中国普通微生物菌种保藏管理中心（编号CGMCC No.7630）；发酵剂Flora、发酵剂STI-13 丹麦科汉森股份有限公司；凝乳酶（酶活力：2 080～2 305 IMCU/mL） 丹尼斯克（中国）有限公司；马铃薯葡萄糖琼脂肉汤培养基、马铃薯葡萄糖肉汤培养基 上海盛思生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

ZWY-2112B水平摇床 天津津立仪器设备科技发展有限公司；MJ-250-Ⅱ恒温培养箱 杭州蓝天仪器有限公司；Thermo 1389生物安全柜 美国Thermo公司；ME2002E/02电子天平、FE20实验室pH计梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；LaB6扫描电子显微镜 捷克Tescan公司；5975气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪（顶空固相微萃取）、1260 Infinity高效液相色谱系统 美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 红曲霉发酵剂的准备

孢子悬浮液制备：将10 mL红曲霉接种于马铃薯葡萄糖琼脂肉汤培养基上，在30 ℃条件下培养1 周，用无菌水洗脱固体培养基上的孢子，镜检孢子悬浮液，随后适当稀释悬浮液，使其浓度为106个/mL。

1.3.2 干酪的制作

红曲霉干酪的制备：参考Jiao Jingkai等[8]方法，牛乳经标准化（脂肪与蛋白质含量比值为1.5∶1～1.7∶1）、巴氏杀菌后冷却至32 ℃，加入商业发酵剂0.04 g/L（其中Flora 0.012 g/L、STI-13 0.028 g/L）与1.3.1节制备的霉菌发酵剂1.5 mL/kg，恒温发酵1.5 h，随后加入凝乳酶0.005 g/kg，待凝乳后进行切割、装模、成型、17 g/100 mL盐水腌渍、晾干等步骤，最后将干酪转移至成熟室进行成熟，成熟21 d时测定除pH值外的其他指标，成熟28 d时测定pH值。对照样品的制备：除发酵剂部分不加入1.3.1节制备的霉菌发酵剂，其余部分相同。干酪得率按下式计算。

式中：m1为投入的牛乳质量/g；m2为成型后的凝乳块质量/g。

1.3.3 干酪理化指标的测定

根据Batty等[20]描述的方法测定干酪的蛋白质、脂肪、钙、水分、盐含量及pH值，重复测定3 次。

1.3.4 干酪游离氨基酸的测定

参考郑晓吉[21]的方法，采用反相高效液相色谱-紫外检测法测定干酪中游离氨基酸。

1.3.5 干酪微观结构的观察

参考郑远荣等[22]的方法，使用扫描电子显微镜观察红曲霉干酪成熟过程中的微观结构。

1.3.6 干酪挥发性成分的定性及定量分析

根据Criste等[23]描述的方法进行修改，利用GC-MS仪进行测定，从50 ℃开始程序升温，保持2 min，以5 ℃/min的速率升至100 ℃，然后以10 ℃/min的速率从100 ℃升至200 ℃，最后保持10 min。GC进样口温度设置为250 ℃，进样在不分流模式下进行，载气为氦气，质谱仪的离子源温度保持在230 ℃，使用电子撞击模式（70 eV），m/z45～450条件下以1 次/s的速率收集数据。依据NIST 11谱库检索，采用峰面积归一化法计算各挥发性物质的相对含量。

1.4 数据处理

数据分析采用SPSS 19.0软件，结果表示为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 红曲霉对干酪理化指标的影响

由表1可知，红曲霉干酪的得率为（16.55±0.67）%，与其他种类干酪（如切达干酪，一般得率为8%～10%）相比得率较高[24]。主要原因是本研究的红曲霉干酪是一种软质干酪，水分含量较高。干酪中的脂肪/蛋白质含量比值会比原料乳略微提高，主要是由于乳清的排放会流失大部分乳清蛋白。钙会随着酪蛋白而保留下来，并且含量得到很大程度的浓缩，在成熟结束时钙含量为（376.67±37.86） mg/100 g，水分含量为（44.47±2.70）%，与硬质干酪、半硬质干酪相比有着较高的水分含量。盐含量为（863.67±54.60） mg/100 g，与其他霉菌成熟干酪的盐含量相比相对较低[24]。盐含量主要和加工过程中添加食盐的量有关，适当的盐度可以抑制杂菌的生长，调节干酪的成熟速率和水解深度，并且给终产品带来良好的风味和滋味。

表1 红曲霉干酪成熟期结束时的理化指标Table 1 Physicochemical indexes of Monascus-fermented cheese at the end of maturation

2.2 红曲霉干酪成熟期间pH值变化

由图1可知，红曲霉干酪在成熟期间发生了pH值中和现象，这与其他霉熟干酪[25-26]相同。实验组干酪在成熟过程中pH值呈现出先下降后上升的趋势，这是由于成熟前期主要由乳酸菌进行产酸活动，分解残留的乳糖。待成熟至7 d左右，随着辅助发酵剂红曲霉的生长，干酪基质中的乳酸成分被消耗，同时释放游离氨基酸脱氨和脱羧过程中产生的碱性物质。成熟期结束时，红曲霉干酪pH值为5.0～5.1，与Langres干酪的pH值接近，低于蓝纹干酪的pH值[25,27]。可能是由于红曲霉的蛋白质水解能力稍弱于蓝纹干酪所用的洛克福特青霉。

图1 红曲霉干酪成熟期间各时期pH值Fig.1 Change in pH value of Monascus-fermented cheese during ripening

2.3 红曲霉干酪中游离氨基酸的测定结果

由表2可知，成熟前后共检测出23 种氨基酸。干酪经过成熟后，游离氨基酸含量明显增加，平均含量从35.2 ng/mg增加到906.2 ng/mg，平均增加58.8 倍。特别是天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸等氨基酸增加幅度均在50 倍以上，增加幅度最高的是天冬氨酸，高达533 倍。成熟后氨基酸含量高于1 000 ng/mg的有赖氨酸、谷氨酸、亮氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和异亮氨酸，其中赖氨酸含量最高，可达2 857.48 ng/mg。异亮氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸、赖氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸8 种必需氨基酸含量从47.2 ng/mg增加到1 205.7 ng/mg，平均增加31 倍。此外，红曲霉发酵的功能性代谢产物γ-氨基丁酸已被证明可以有效改善抑郁症及发挥血压调节作用[28]，在该干酪成熟期结束时，γ-氨基丁酸含量高达328.14 ng/mg。

表2 红曲霉干酪成熟前后游离氨基酸含量Table 2 Changes in free amino acid contents before and after the ripening of Monascus-fermented cheese ng/mg

2.4 红曲霉干酪微观结构的变化

由图2可知，对照组酪蛋白微观网络结构更加完整和清晰，中间孔洞较大。与对照组干酪相比，实验组红曲霉干酪的微观结构比较模糊，内部孔洞更小，表明红曲霉菌株对成熟干酪的内部结构有明显影响，红曲霉菌株分泌的胞外蛋白酶对干酪中蛋白质和脂肪等成分进行了不同程度的水解，使其内部结构进行了重新排列。从宏观上来看，对照组干酪外观较硬且富有弹性，而红曲霉干酪内部则出现一定的软化塌陷，但未出现流心质地。干酪的微观结构是由酪蛋白基质组成的，酪蛋白是连续相，脂肪和水分等分散在其中，形成空穴结构；而实验组红曲霉干酪中红曲霉的蛋白水解能力比乳酸菌强，在成熟过程中，以酪蛋白为主的网络结构骨架分解塌陷，与脂肪、水分混合在一起，从而形成相对致密的微观结构。

图2 成熟21 d红曲霉干酪扫描电子显微图Fig.2 Scanning electron micrograph of Monascus-fermented cheese matured for 21 days

2.5 红曲霉干酪挥发性风味物质分析

由表3可知，通过GC-MS方法在成熟期结束时于对照组与实验组干酪中鉴定出32 种挥发性化合物，其中包括12 种酯类、16 种醇类、3 种酮类、1 种醛类。红曲霉软质干酪从成熟前到成熟后，呈味酯类物质明显增多，醇类物质含量明显降低，整体上干酪风味物质更加丰富。

表3 红曲霉干酪成熟前后挥发性风味物质组成Table 3 Changes in composition of volatile flavor compounds before and after the ripening of Monascus-fermented cheese

2.5.1 酯类挥发性化合物

红曲霉软质干酪的主要挥发性风味成分包括酯类，共鉴定出12 种酯类物质，在成熟前占总挥发性化合物含量的6.26%，成熟后占总挥发性化合物含量的54.7%。其中，乙酯类物质占比最大，一些乙酯类物质可提供果香味，如乙酸乙酯、辛酸乙酯等[29]。与对照组相比，成熟后干酪中乙酯类物质的含量显著增加。此外，在实验组还发现了己酸-2-甲基丙酯、甲酸辛酯和己酸异戊酯等，这些物质是实验组独有的。因此，可以合理推测，这些实验组中独有的酯类物质是导致红曲霉软质干酪风味的重要挥发性物质。

2.5.2 醇类挥发性化合物

醇类物质为含量最高的风味成分，占总挥发性化合物含量的25.94%。与对照组相比，实验组干酪中的醇类物质种类及含量均有所下降。在成熟21 d时，主要醇类物质为乙醇，通常在干酪中由乳酸菌发酵乳糖产生，其次是3-甲基-1-丁醇和苯乙醇。其中，3-甲基-1-丁醇能带来令人愉悦的新鲜干酪味[30]，2-庚醇与2-壬醇可为干酪提供奶油香气[31]。

2.5.3 其他挥发性化合物

其他挥发性化合物包括酮类、醛类，种类均较少。从成熟21 d干酪中挥发性化合物的检测结果来看，酮类物质占所有挥发性化合物的12.82%。其中，2-庚酮的含量最为丰富，且为实验组中独有的成分，对照组中并未检出，其次是2-戊酮和2-壬酮，它们都是蓝纹干酪成熟过程中脂肪酸分解而导致的特征风味物质[32]。与此同时，从成熟期结束时的测定结果来看，醛类物质的含量与种类并没有得到提高，这可能是因为它们被还原为相应的醇类物质[30]。

3 结 论

利用红曲霉发酵液制备霉菌成熟干酪，并对成熟前后干酪的理化性质、微观结构和风味物质进行研究。结果表明：红曲霉干酪在成熟期结束时的理化性质较其他品种干酪及对照组差异显著，尤其是干酪得率为16.55%，显著高于其他品种干酪，盐含量为863.67 mg/100 g，显著低于其他霉熟干酪的平均水平；在成熟过程中，红曲霉干酪pH值和其他霉菌成熟干酪一样呈现出酸中和的现象；成熟期前后，共鉴定出23 种游离氨基酸，成熟前后平均增长幅度高达58.8 倍，这些游离氨基酸对红曲霉干酪的风味形成具有重要贡献，部分游离氨基酸还具有一定功效性，如γ-氨基丁酸；在红曲霉干酪中，共检测到32 种挥发性化合物，其中醇类物质初始含量最高，成熟后酯类物质含量最高，其中出现一些实验组独有而对照组中不存在的化合物，认为这些物质是导致红曲霉干酪形成特征风味的主要物质。通过以上研究，认为红曲霉适宜作为干酪的辅助发酵剂，对干酪成熟具有积极作用，可为干酪带来感官较佳的特征风味物质。