胡小祥，王继威，刘冠琼，何艳（.郴州市食品药品检验检测中心，湖南 郴州 423000；2.湘南学院药学院，湖南 郴州 423099）

杜仲平压分散片是由杜仲叶单味药材经水煎煮、醇沉、浓缩制成的片剂，具降血压，强筋健骨之功效，临床用于治疗高血压和骨质疏松病。杜仲叶含有多种有效成分，主要有苯丙素类、环烯醚萜类和黄酮类成分[1]，其中苯丙素类主要有绿原酸、新绿原酸和隐绿原酸等[2-3]，环烯醚萜类主要有京尼平苷酸等[4]，黄酮类主要有芦丁、异槲皮苷等[5-6]。现代药理学研究表明，绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸具有利胆、抗炎、抗病毒、降血压等功效[7-8]。京尼平苷酸具有抗炎、抗骨质疏松等功效[9-10]。芦丁、异槲皮苷具有降血压、抗骨质疏松等作用[11-12]。杜仲平压分散片现行质量标准仅对绿原酸进行含量测定，而相关文献也仅测定绿原酸的含量[13]，涉及的活性成分有限。因此，为了更加全面地反映该制剂的内在质量，本研究采用HPLC 法同时测定制剂中京尼平苷酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁和异槲皮苷的含量，以期为完善该制剂的质量控制方法提供依据。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1260 型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Mettler XSE-205 型十万分之一电子天平（精度：0.01 mg，瑞士梅特勒公司）；KQ-500D超声清洗器（昆山超声仪器有限公司）。

1.2 试药

对照品京尼平苷酸（批号：111828-201805，纯度：98.1%）、绿原酸（批号：110753-202018，纯度：96.1%）、芦丁（批号：100080-201811，纯度：92.4%）、异槲皮苷（批号：111809-201804，纯度：97.2%）（中国食品药品检定研究院），对照品新绿原酸（批号：MUST-21030108，纯度：99.67%）、隐绿原酸（批号：MUST-21082601，纯度：99.88%）（成都曼思特生物科技有限公司）。乙腈、甲醇（色谱纯，德国Merck 公司）；磷酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；水为怡宝纯净水。杜仲平压分散片（批号：201105、210101、210601、210701，规格：0.55 g/片，湖南方盛制药股份有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Thermo Hypersil Gold-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0～15 min，5%～18%A；18～25 min，10%～16%A；25～35 min，16%A；35～40 min，16%～25%A，40～41 min，25%～5%A，41～45 min，5%A）；流速为1.0 mL·min－1；检测波长为238 nm（京尼平苷酸）、327 nm（新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸）、354 nm（芦丁、异槲皮苷）；柱温为30 ℃；进样体积为10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 分别精密称取对照品京尼平苷酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁、异槲皮苷6.85、12.50、11.81、13.18、5.85、5.31 mg，分别置25 mL 量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成各对照品储备液。分别精密吸取各储备液1、2、3、2、1、1 mL，置同一10 mL 量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，得质量浓度分别为26.88、99.67、136.2、105.3、21.62、20.65 μg·mL－1的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取杜仲平压分散片10 片，研细，取约1.5 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，称重，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，过0.45 μm 滤膜，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按杜仲平压分散片处方工艺，制成只含辅料的阴性样品。取阴性样品适量，按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。

2.3 专属性试验

分别取“2.2”项下的3 种溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果供试品色谱图中京尼平苷酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁和异槲皮苷6 个成分在与混合对照品色谱图相同的保留时间上有色谱峰出现，与相邻色谱峰之间达到较为理想的分离效果，分离度均大于1.5，阴性样品无干扰，表明方法专属性良好，见图1。

图1 杜仲平压分散片的HPLC 色谱图Fig 1 HPLC chromatogram of Duzhong Pingya dispersible tablets

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系、检测限和定量限考察 取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，分别精密吸取1、2、4、6、8、10 mL 置10 mL 量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度得系列对照品溶液，分别取适量，进样测定峰面积。以质量浓度（μg·mL－1）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得回归方程和线性相关系数。结果6 种成分在各自线性范围内与峰面积呈良好的线性关系，见表1。另取混合对照品溶液适量，用50%甲醇逐步稀释，当S/N为3∶1 时测得检测限（LOD），当S/N为10∶1 时测得定量限（LOQ），见表1。

表1 6 种成分的线性关系、检测限和定量限Tab 1 Linearity，LOD and LOQ of 6 components

2.4.2 精密度试验 取线性曲线第3 个点的对照品溶液适量，连续进样测定6 次，测定各成分的峰面积，计算RSD。结果京尼平苷酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁和异槲皮苷峰面积的RSD分别为0.24%、0.10%、0.43%、0.28%、0.26%和0.21%，表明仪器的精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 取批号为210101 的样品适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别在0、3、6、12、16、21 h 进样测定，结果供试品中京尼平苷酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁和异槲皮苷峰面积的RSD分别为0.95%、0.29%、0.32%、0.27%、0.62%和0.69%，表明供试品溶液在21 h 内稳定性良好。

2.4.4 重复性试验 取批号为210101 的样品适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算各成分含量。结果京尼平苷酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁和异槲皮苷含量的平均值分别为0.2402、1.338、2.380、1.629、0.1395、0.2066 mg·g－1，RSD分别为0.17%、0.43%、0.65%、0.61%、1.2%、1.6%，表明方法的重复性良好。

2.4.5 加样回收试验 取含量已知的杜仲平压分散片（批号：210101）的样品，研细，取约0.75 g，精密称定，共6 份。按上述6 个成分含量的100%分别加入各单一对照品溶液（0.1882 mg·mL－1京尼平苷酸1 mL、0.3321 mg·mL－1新绿原酸3 mL、0.4540 mg·mL－1绿原酸4 mL、0.4099 mg·mL－1隐绿原酸3 mL、0.1081 mg·mL－1芦丁1 mL、0.1652 mg·mL－1异槲皮苷1 mL），剩余体积用50%甲醇补足，然后按“2.2.2”项下方法制备，进样测定，计算各成分的回收率。结果京尼平苷酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁、异槲皮苷平均加样回收率分别为99.16%、100.86%、104.76%、104.12%、101.13%、101.80%，RSD分别为1.6%、1.8%、1.1%、1.1%、2.3%、2.0%。

2.5 样品含量测定

取杜仲平压分散片样品4 批，分别按“2.2.2”项下方法制备，进样测定，记录峰面积，通过回归方程计算供试品中各成分的含量，结果见表2。

表2 杜仲平压分散片中各成分含量测定结果(mg·g－1，n＝2)Tab 2 Content of each ingredient in Duzhong Pingya dispersible tablets (mg·g－1，n＝2)

3 讨论

3.1 测定波长的选择

采用DAD 检测器分别对6 个成分在200～400 nm 内进行扫描，结果京尼平苷酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁和异槲皮苷分别在238、327、327、327、354、354 nm 处有最大吸收，兼顾各色谱峰出峰时间，故选择238 nm（检测京尼平苷酸）、327 nm（检测新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸）、354 nm（检测芦丁、异槲皮苷）作为检测波长。

3.2 色谱条件的优化

采用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸作为流动相体系进行考察[14-16]，结果以乙腈-0.1%磷酸为流动相体系时，6 个成分色谱峰峰形、分离度最好，当增加磷酸浓度时，6 个成分色谱峰峰形无明显变化，故选择乙腈-0.1%磷酸作为流动相。再考察不同色谱柱[Agilent ZORBAX SB C18、Waters sunfire C18、Thermo Hypersil Gold-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]、不同温度（25、30、35 ℃）、不同流速（0.9、1.0、1.1 mL·min－1）对6 个成分测定的影响，结果在上述条件下，6 个成分均达到了较好的分离，说明方法耐受性较好。

3.3 提取方法的选择

预试验考察了不同提取溶剂（乙醇、70%乙醇、50%乙醇、甲醇、70%甲醇）对6 个成分提取效果的影响，结果不同乙醇浓度提取的供试品色谱峰峰形有不同程度的拖尾，而以50%甲醇提取的供试品各成分峰形较佳，提取率最高。还考察了超声和回流两种提取方式，发现超声提取用时明显短于回流提取，且超声提取30 min 时，6个成分基本提取完全。最后考察50%甲醇用量（50、100 mL）对6 个成分提取的影响，发现两种体积下6 种成分的含量基本成比例，故最终确定供试品溶液制备方法为50%甲醇50 mL 超声提取30 min。

3.4 小结

本试验建立了HPLC 法同时测定杜仲平压分散片中京尼平苷酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁和异槲皮苷的含量，涵盖了该制剂中与功能主治一致的主要有效成分，该方法简单准确、重复性好，可为该制剂质量控制方法的完善提供依据。