王鹏 邱振东 张利龙 左腾 李凯 陈辰 王卫星

胆囊癌在肝外胆道系统恶性肿瘤中的发病率约占80%～95%[1-2]。由于缺乏早期临床表现，胆囊癌一旦发现病情多处于进展期[3]。胆囊具有丰富的淋巴组织及血供，胆囊癌细胞易向邻近器官侵犯并随血液系统或淋巴管向远处转移，预后差， 5年生存率约为32%，是消化道肿瘤中恶性程度较高的一类肿瘤[4-5]。胆囊癌的主要治疗方式为手术，放化疗以及姑息治疗是其辅助治疗手段[5-7]。白细胞分化抗原74(cluster of differentiation 74,CD74)作为一种具有多种免疫功能的Ⅱ型跨膜蛋白，在炎症以及多种恶性肿瘤中均有表达，是肿瘤细胞增殖及多种实体肿瘤发生发展的重要因子[8-10]。本研究拟通过测定胆囊癌组织中CD74的表达水平以及其与胆囊癌的临床病理相关性以及其与已知肿瘤标志因子表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor ，EGFR)的相关性，探讨CD74在胆囊癌中的作用及其相关机制。

对象与方法

一、对象

我院2016年9月～2021年9月间收治的胆囊癌病人54例，男性17例，女性37例，平均年龄为61.2岁，所有病人术前均未接受新辅助化疗或放疗，排除肝脏肿瘤转移至胆囊所致的转移癌。

二、方法

1.试剂：兔抗人EGFR抗体，购自北京中杉金桥公司。通用免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒购自Thermo公司。

2.免疫组化检测：采用SP法测定胆囊癌组织中的CD74以及EGFR的表达情况[11]。

3.Western blot检测：组织蛋白提取并Western blot法检测CD74在胆囊癌中的表达情况，将液氮中冻存的肿瘤组织秤取50 mg，液氮研磨后,提取蛋白，蛋白变性，电泳，转膜，封闭，孵育一抗，孵育二抗，采用Odyssey双色红外荧光成像系统扫膜，分析。

4.免疫组化结果判定：免疫组化结果判定由2位有经验的病理科医师独立完成，其均对病人临床资料未知。免疫组化图片采用OLYMPUS BX53正置显微镜拍照。CD74阳性表达为细胞胞浆内有黄色或棕黄色沉着。每张病理切片随机选择5个200倍视野镜下拍照。采用Image-pro Plus 6.0图片分析软件对染色的面积、密度、光密度值进行分析。综合染色强度和细胞着色率对免疫组化结果进行评分：0分，不着色；1分，淡黄色着色；2分，黄色染色；3分，棕黄色染色。对于细胞着色率亦进行评分：0分，0～5%细胞着色；1分，6%～25%细胞着色；2分，26%～50%细胞着色；3分，>50%细胞着色。综合每张切片的平均染色强度评分和平均细胞着色率评分之和，0分阴性，1～2分弱阳性，3分阳性，4～6分强阳性。0～2分定义为阴性表达，3～6分定义为阳性表达[12]。

三、统计学方法

应用SPSS19.0软件对数据进行分析。CD74表达情况比较采用χ2检验，多因素Logistic回归分析显著性差异的因素 。应用Spearman秩相关性分析CD74表达水平与EGFR水平的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

在正常胆囊组织中CD74呈阴性表达。54例胆囊癌病人中CD74的表达情况与临床病理特征的关系见表1。通过Logisitic多因素分析表明，肿瘤的浸润深度和TNM分期是影响CD74表达的独立因素(见表2)。在胆囊癌组织中分化程度低的胆囊癌组织CD74表达强于分化程度好的胆囊癌组织(图1)。Western blot技术分析同样印证了CD74在分化差的胆囊癌组织中表达上调(图2)。54例病人中，CD74的表达与性别、年龄无明显差异性(P>0.05);分化差的胆囊癌中CD74的表达高于中分化及低分化胆囊癌。反应肿瘤浸润程度的T分期，T分期晚的胆囊癌组织CD74表达高于T分期较早的胆囊癌组织，但与肿瘤组织的N分期尚无明显差异；TNM分期较早的胆囊癌与分期较差的胆囊癌组织中CD74的表达具有明显差异(表1)。EGFR在胆囊癌中的表达情况见图3。通过免疫组化分析细胞浆中阳性染色情况，54例胆囊癌切片，均有EGFR的阳性表达(评分>3分)。通过Spearman秩相关分析CD74与EGFR表达的相关性，结果表明，CD74的IHC的IOD值与EGFR的IOD值呈正相关。CD74在不同分化程度的胆囊癌组织中的IOD值以及同EGFR之间的相关性，见图4。

表1 CD74在胆囊癌中的表达与病人临床病理特征的关系(例)

CD74在胆囊癌组织中的表达情况。A：PBS阴性对照组；B：正常胆囊组织中CD74的表达情况；C：高分化胆囊癌组织中CD74的表达情况；D：中分化胆囊癌组织中CD74D的表达情况；E：低分化胆囊癌组织中CD74的表达情况；F：阳性对照(结肠癌组织)

表2 肿瘤分化程度、浸润深度以及TNM分期的多因素Logistic分析

P:低分化的胆囊癌组织；W：高分化胆囊癌组织;M:中分化的胆囊癌组织图2 Western blot 检测不同分化程度的胆囊癌组织中CD74的表达情况

A：与高分化组比较，aP<0.05；与中分化组比较，bP<0.05;B：中CD74的表达IOD值与EGFR呈正相关，系数为0.607

讨论

胆囊癌的临床表现与慢性胆囊炎以及胆石症有一定的重叠，绝大多数胆囊癌病人就诊时，疾病大多处于进展期。进展期胆囊癌的预后差，其5年生存率约为32%[13]，是消化系疾病中预后较差的肿瘤之一。

A：低表达； B：高表达图3 EGFR在胆囊癌中的表达情况(SP×200)

CD74在血液系统肿瘤以及多种实体肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用。本研究结果表明，CD74在胆囊癌组织中过表达，且在低分化胆囊癌中的表达明显高于高分化胆囊癌。Western blot结果提示，CD74的表达在低分化胆囊癌中表达升高，这同样在蛋白水平印证了实验结果。CD74的表达与胆囊癌的分化程度、肿瘤浸润深度即T分期以TNM分期具有明显的相关性，其差异有统计学意义，而与病人的年龄、性别以及淋巴结转移情况无明显相关性，TNM分期与淋巴结转移有明显关联。本研究结果表明，CD74在54例胆囊癌病人中有35例阳性表达，其中T3-T4分期有25例，与胆囊癌的浸润深度有明显差异，但在有无淋巴结转移方面，淋巴结转移阳性病人中CD74的表达有18例，无淋巴结转移组CD74阳性有17例,通过线性分析淋巴结转移情况与T分期的相关性，其结果表明，T分期与淋巴结转移情况无明显相关性，差异无统计学意义。

CD74是MHC-Ⅱ的固定链，是一种跨膜蛋白，其在抗原提呈细胞如B细胞、单核细胞以及巨噬细胞中的表达明显升高，D-CD74复合物对于宿主的免疫反应具有抑制作用，此作用促进了肿瘤细胞的增殖。大量研究表明，CD74在恶性肿瘤中的过表达可以阻断肿瘤细胞内源性的抗原提呈作用，从而导致免疫逃逸。在B细胞淋巴瘤以及多发性骨髓瘤中CD74已经被报道作为一种新的治疗靶点，在非血液系统恶性肿瘤中如胃癌，肾癌以及非小细胞肺癌中CD74也已经被报道作为一种新的标志物，且具有预测预后的作用[14-15]。

在本研究中，低分化胆囊癌组织中CD74的免疫组化平均IOD值高于中分化以及高分化胆囊癌组织，Western blot 结果同时印证了这样的结果。CD74的致癌机制与MIF具有重要的关联，MIF是重要的炎症因子，CD74与MIF复合物是作为受体/配体复合物参与慢性炎症及慢性炎症向肿瘤发展的过程。其可能的机制是通过封闭p53这种抑癌基因，阻碍p53的跨膜行为，阻止p53进入细胞核内，阻断其所介导的凋亡过程。因此，导致细胞的增殖增多，介导上皮增殖[16-17]。CD74与MIF的复合物还可以通过EGFR增加上皮细胞的增殖，EGFR作为多种实体肿瘤的靶向治疗点，其参与肿瘤的增殖、迁徙以及浸润转移的重要过程[18]。CD74与MIF复合体通过上体白细胞介素-8来上调EGFR的表达水平，而EGFR是生长因子家族的重要成员之一，其主要功能为调控细胞的生长、增殖以及分化，在正常细胞的生理过程中其作用十分重要。目前，在肿瘤细胞中，针对EGFR靶点的治疗已经广泛应用，如肺癌、肾癌等实体肿瘤[19]。本研究通过Spearman秩相关得出以下结论，CD74的表达水平与EGFR呈正相关，即胆囊癌中高表达CD74的样本中EGFR的表达同样高表达，CD74可能与细胞的EGFR具有相关性，其可能是治疗胆囊癌的潜在治疗靶点之一。

综上，通过免疫组化以及Western blot分析CD74以及EGFR在胆囊癌中的表达，结果表明，CD74与EGFR呈正相关,且与病人的临床病理特征明显相关，CD74是参与胆囊癌发生发展的重要因子。