陈晗璐 吴盛海,2

1 浙江中医药大学第四临床医学院, 杭州 310006；2 浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院检验科，杭州 310006

肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）是 1944 年 Eaton等[1]通过组织培养，首次从一名原发性非典型肺炎患者的痰液中分离而来，被称为“Eaton”病原体。 肺炎支原体感染除引起下呼吸道感染 (LRTIs) 外，还可以累及其他器官，包括皮疹和黏膜炎症[2]、多形性红斑[3]和Stevens-Johnson 综合征/中毒性表皮坏死松解症[4]以及神经系统症状和血液系统症状等，还可以引起原发性体液免疫缺陷患者的关节炎[5]以及儿童哮喘[6]。 由于许多临床指南并不推荐病原学检测作为肺炎支原体感染的治疗依据，临床医生往往通过经验性使用大环内酯类抗菌药物进行治疗。 目前肺炎支原体对大环内酯类药物耐药性不断上升， 包括中国在内的亚洲国家耐药率高达70%~100%[7-8]，因此抗感染治疗的效果被高估，导致患者不能得到及时有效的治疗， 极有可能会导致其他病原体的合并感染，引起更为严重的后果。 本文就肺炎支原体感染的主要致病机制及实验室检测研究进展进行综述。

一、肺炎支原体感染的流行病学特征

肺炎支原体主要通过呼吸道飞沫在人际间传播，引起呼吸道感染，多见于儿童和老年人。 肺炎支原体感染占社区获得性细菌性肺炎发病的4%~8%，流行期间可达20%，密切接触者高达70%[9-11]。 肺炎支原体感染的暴发通常发生在新兵营、医院、疗养院和其他长期护理机构等人群密集机构[12]，5%~10%的肺炎支原体感染者会发展成肺炎支原体肺炎[13]。 我国尚未开展全国性肺炎支原体感染流行病学相关监测，总体发病率尚不清楚。 在呼吸道感染的患儿中，肺炎支原体的构成比为20%~30%，不同的地区有所差异，女童要明显高于男童[14-15]。

肺炎支原体的分型主要包括基于黏附素蛋白P1 的分型、多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)、细菌多位点序列分型(MLST) 和单核苷酸多态性（SNP）基因分型等方法，其中P1 分型和MLVA 应用比较广泛[16]。 不同地区流行的型别，菌株耐药性均有不同。 中国以P1 中的1 型为主，这种耐药主要与23S rRNA V 区 A2063G 突变相关， 且这种耐药菌株主要集中在MLVA 分型中的 M4-5-7-2 型[7]。

二、肺炎支原体致病机制

1. 黏附与滑动

扫描电镜显示，肺炎支原体呈逗号形或梭形，一端有一种复杂而特殊的附着细胞器（OA），这是一个与细胞膜连续的长约290 nm 的极性细胞突起[17]，其与宿主上皮细胞紧密连接，保护它不被宿主的上皮细胞纤毛清除机制清除。 OA 中存在两大类与运动和细胞黏附相关的蛋白质：一类是与黏附和滑动直接相关的蛋白质，另一类是以细胞骨架核心的形式提供潜在结构和组织支持的蛋白质。 肺炎支原体的细胞骨架核心是OA 形成和黏附素定位到该细胞极所必需的, 高分子量蛋白(HMW)1 和HMW2 构成细胞骨架结构的平行薄板和厚板。HMW3 和P65 形成远端复合体，与跨膜的P30 连接。 近端的碗状复合体包括 P200、MPN387、P41、TopJ 和 P24，其中 P200和MPN387 都与运动有关，P41 在稳定OA 中起关键作用[16]。此外，宿主受体部分的性质和密度也反过来影响肺炎支原体的滑动，进而影响肺炎支原体的致病机制和感染结局[18]。对肺炎支原体滑行的研究表明，这种滑行运动是持续围绕极性的突起旋转，肺炎支原体的这种黏附和滑动能力参与了感染过程，使其能够从支气管纤毛尖端转移到宿主细胞表面[19]。

2. 吞噬与融合

肺炎支原体是黏膜病原体， 存在于上皮细胞外表面，已经证实其可以通过与非正常吞噬的宿主细胞融合并进入宿主细胞[20]。 Dallo 和Baseman[21]报道了肺炎支原体可以在人工细胞培养系统中存活、合成DNA 并进行复制。 肺炎支原体在细胞内存活可能与感染的潜伏期或慢性感染相关，进而逃避机体的免疫机制，促进其跨越黏膜屏障进入内部组织，因此也削弱了某些药物治疗的疗效，导致临床治愈困难[20]。 膜融合还可引起细胞膜受体识别位点的变化，影响细胞间的信号传递和细胞因子的产生[22]。目前，肺炎支原体在体内的侵袭和细胞内复制的程度尚不清楚。

3. 细胞毒性

黏附为肺炎支原体诱导局部细胞毒作用提供了条件。 肺炎支原体黏附在支气管细胞表面后，穿透支气管黏膜，释放核酸酶和过氧化氢，导致支气管上皮细胞肿胀、坏死和结合，微绒毛运动减慢，从而诱导淋巴细胞、浆细胞和单核细胞的浸润[23-24]，这些作用可能与肺炎支原体呼吸道感染的临床表现相关，比如常见的持续性干咳。 一旦肺炎支原体到达下呼吸道，可能被激活的补体或抗体结合，从而导致巨噬细胞向感染部位趋化迁移并开始吞噬，临床表现为肺泡液中有高比例的中性粒细胞和淋巴细胞[25]。 肺炎支原体可能通过自身产生过氧化氢来调节感染的上皮细胞脱落，这一机制有助于维持它的定植状态[26]。最近研究发现，社区获得性呼吸窘迫综合征毒素 (CARDST) 是肺炎支原体的重要毒力因子。 肺炎支原体接触宿主细胞后， 诱导其毒素编码基因 (MPN372) 转录，CARDST 水平升高。 在动物模型中， 肺炎支原体的CARDST水平与疾病严重程度之间的正相关性进一步揭示了这种毒素作为疾病决定因素的重要性[27]。

4. 机体的免疫反应和炎症损伤

一旦肺炎支原体到达下呼吸道， 就会被抗体和补体调理，然后被激活的巨噬细胞吞噬。 中性粒细胞浸润对肺炎支原体肺炎的肺损伤有促进作用， 但不参与清除肺炎支原体，电镜下显示中性粒细胞表面附着并吞噬肺炎支原体，吞噬泡中的肺炎支原体依旧活跃[28]。Lai 等[29]在小鼠模型中证明了肺巨噬细胞在控制肺炎支原体感染中的重要作用。 巨噬细胞的激活及随后对肺炎支原体的杀灭依赖于Toll 样受体(TLR)，特别是TLR2 的识别[30-31]。 肺炎支原体以热休克蛋白(HSP-1)依赖的方式诱导TLR2 的表达，TLR2 的过度表达与大量肺炎支原体的相互作用导致免疫细胞的过度活化有关，并因此诱导肺炎支原体相关的并发症[32]。

肺炎支原体感染产生的特异性分泌型免疫球蛋白（sIgA）可以保护呼吸道黏膜免受再次感染，肺炎支原体肺炎急性期和恢复期血清中IgG、IgM、IgA 和免疫复合物含量均显著升高，重症患者更为明显[33]。 虽然已知B 细胞，主要是通过IgG介导参与肺炎支原体在肺部的清除， 但在上呼吸道肺炎支原体清除方面的作用有限[34-35]。 肺炎支原体不仅是一种感染源，对某些个体也是一种过敏原。 MP 的P1 蛋白可诱导P1 特异性IgE 的产生， 从而诱发IgE 介导的气道炎症和气道高反应性[36]。 慢性稳定期哮喘患者的呼吸道检出肺炎支原体阳性率高于非哮喘患者[37]，但肺炎支原体是否是哮喘的主要原因尚不清楚。

三、肺炎支原体实验室检测方法

肺炎支原体感染实验室检测包括肺炎支原体培养、肺炎支原体抗原检测、肺炎支原体血清学检测以及分子生物学方法检测肺炎支原体及其耐药基因等。

1. 肺炎支原体培养

由于肺炎支原体生长缓慢， 需要3～4 周甚至更久的时间，因此肺炎支原体培养方法在实验室并不被常规使用。 目前市面上出售的肺炎支原体快速培养检测试剂盒主要利用的是肺炎支原体分解葡萄糖产酸使液体培养基pH 改变，从而导致酚红指示剂变色。 由于上呼吸道存在唾液支原体、口腔支原体以及其他菌群的正常定植，往往会导致结果解释困难，需要通过PCR 方法确认。 尽管肺炎支原体培养很少用于指导急性肺炎支原体感染的治疗，但通过培养获得分离菌株从而进行抗菌药物敏感性试验和（或）分型，对获得流行病学相关数据，并指导肺炎支原体感染的防控和经验治疗具有极大价值。 如何优化培养基及培养流程，是临床微生物工作者有待解决的难题[38-39]。

2. 抗原检测

抗原检测用于直接检测样本中肺炎支原体特异性抗原，阳性结果可作为早期感染依据之一。 样本处理后加入鼠抗人肺炎支原体单克隆抗体，应用荧光素标记羊抗鼠抗体IgG 来检测抗原，通过观察被特异荧光标记的肺炎支原体来判断是否感染[40]。量子点是一种新型荧光材料，量子点免疫层析技术是近年发展起来的抗原、抗体快速检测方法。 采用该方法检测肺炎支原体天然抗原最低检测限为0.38 μg/mL，与PCR 荧光探针法比较，总符合率达到95.4%[41]。

3. 血清学检测

肺炎支原体感染人体后产生相应的IgA、IgM、IgG 类抗体，不同类型抗体的出现、达峰和维持时间不同。 在最初感染之后， 正常的免疫系统针对蛋白质和糖脂抗原产生抗体，包括对P1 黏附素蛋白和CARDST 抗体， 通常可在临床疾病发作后约1 周内检测到IgM/IgA， 随后约2 周后检测到IgG，抗体水平在3~6 周后达到峰值，随后在数月至数年内逐渐下降[16]。

血清学检测方法主要包括补体结合试验(CFA)、胶体金免疫层析法(GICA)、间接免疫荧光试验(IFA)、ELISA、颗粒凝集试验(PA)和冷凝集实验（CAT）等。 目前实验室最常用的为ELISA 和PA。 ELISA 具有较高的灵敏度和特异性，可定量检测血清 IgA、IgM 和IgG 抗体表达；PA 试验采用混合肺炎支原体抗原同时检测IgM 和IgG，检测方法重复性好，具有较好的特异性和灵敏度[41]。 作为肺炎支原体感染的实验室检测手段之一，血清学方法具有先天的不足，包括试验方法缺乏统一标准，对于阳性结果的判定及其应用价值尚未达成共识[16]等。一般患者急性期和恢复期血清滴度呈4 倍增高可诊断肺炎支原体现症感染[42]，但往往是回顾性诊断，临床应用价值有限。

4. 分子生物学检测

核酸扩增检测技术(NAATs) 具有特异性高、样本周转时间短、检测速度快等优点，联合血清抗体检测，可为诊断肺炎支原体提供明确依据。 尽管缺乏广泛的培养验证，但NAATs由于具有更高的分析灵敏度和更短的周转时间，使其被认为是新的“金标准”，例如FilmArray 可以同时检测包括肺炎支原体在内的20 种不同的呼吸道细菌和病毒[43]，GeXP 可以同时检测11 种引起呼吸道感染的病原体[44]。 基于NAATs 开发的POCT 方法在肺炎支原体单一病原检测也是目前研究的热点，Smart Gene 和ELITech 不仅能够完成肺炎支原体检测，还可以检测肺炎支原体23S rRNA 基因V 区点突变情况， 能进一步指导临床医生在抗感染治疗中的药物选择[45]。

四、结语与展望

下呼吸道感染是全世界5 岁以下儿童发病和死亡的主要原因，其中肺炎是重要的原因之一[46]。引起肺炎的病原学复杂，且临床表现缺乏特异性，因此，在肺炎支原体感染的诊断中， 涵盖多靶位的下呼吸道感染病原NAATs 方法具有重要价值。 由于肺炎支原体缺乏细胞壁，加上经验性大环内酯类抗菌药物的使用，导致肺炎支原体耐药性增加，应对肺炎支原体感染的预防和控制，靶点药物和疫苗具有较好的临床应用前景。 雷帕霉素激酶抑制剂作为一种大环内酯类化合物和细胞增殖抑制剂，最有希望成为危重肺炎支原体肺炎治疗的候选药物[47]。 有学者针对 T 细胞(HTL 和 CTL)、B 细胞和 IFN-γ筛选的4LBL、7CTL 和5HTL 表位，利用免疫学技术和分子对接相结合的方法设计的针对肺炎支原体的多表位疫苗[48]，可以通过选择和组合最有效的抗原表位来诱导细胞和体液免疫应答，与减毒疫苗或灭活疫苗相比，这种疫苗可以诱导强烈的免疫反应，并且不良反应较小。 总之，研究肺炎支原体感染过程中与机体相互作用的机制，对于开发新的诊断和治疗方法具有重要的现实意义。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突