西瓜果皮颜色及单性花关键基因定位与候选基因筛选

2022-11-11栾非时倪博新刘宏宇

东北农业大学学报 2022年10期

栾非时，倪博新，刘宏宇，刘识

（1.农业农村部东北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，哈尔滨 150030；2.东北农业大学园艺园林学院，哈尔滨 150030）

西瓜[Citrullus lanatus（Thunb.）Matsumura&Nakai]是全球受欢迎水果之一，种植广泛。中国作为西瓜生产和消费大国，西瓜产业发展迅速，产量、面积均位居世界第一[1]。20世纪30年代以来各国研究者围绕西瓜性状开展遗传研究，如果肉颜色[2]、果实形状和大小[3]、果皮相关性状[4-5]，开花习性等重要目标性状[6]。西瓜果实外部形态分为果实形状、表皮颜色、条纹（清晰或扩散）、条纹颜色和宽度等。内部形态主要包括果皮厚度、果肉颜色和硬度。西瓜果皮外观影响消费者评价标准，是重要育种性状，选择符合大众期望的果皮外部性状是育种主要目标。20世纪30年代末和40年代初，研究人员建立关于西瓜果皮表面相关性状遗传模型，西瓜果皮颜色及条纹由3个等位基因G、gs和g控制，控制条纹的基因gs对等位基因G（深绿色果皮）为隐性，但gs对浅绿色果皮g为显性[3,7]。Lou和Wehner在上述研究基础上，提出西瓜果皮和条纹颜色遗传模式，G基因座上有5个等位基因：G（深绿色果皮）、gW（果皮宽条纹）、gM（果皮中宽条纹）、gN（果皮窄条纹）和g（浅绿色表皮），显性效应为G＞gW＞gM＞gN＞g[8]。Park等将控制西瓜黄色果皮的基因Dgo定位到4号染色体前端[9]。Yang等对黄-绿色果皮、深绿-浅绿色果皮，有无条纹3个控制果皮表型的性状开展遗传和连锁分析发现，3个性状均受单基因控制，其中黄色果皮对绿色果皮为显性，深绿色果皮对浅绿色果皮为显性，条纹对无条纹为显性[10]。

植物授粉率和座果率与植株体性别表达关系密切。被子植物花器官包括雌花、雄花和完全花，不同组合方式使植株以7种主要性别形式存在：雌雄异花同株性型、雄全同株性型、雌全同株性型、雌花雄花完全花性型、完全花株性型、全雌株和全雄株性型[11]。国内外研究学者已对葫芦科作物性别分化开展大量研究。黄瓜植株性别由三对等位基因共同决定，分别为M/m、F/f和A/a基因，其中M基因控制单性花发育，m基因控制完全花发育，F基因控制雌花发育，a基因参与控制雄性系发育[12-14]。甜瓜性别分化受3个基因控制，为a、g、m基因，a基因与雄全同株发育相关；g基因控制全雌株性状；m基因与雌全同株和三体同株性型相关[15]。西瓜中，Rosa以西瓜雌雄异花同株和雄全同株为材料开展遗传分析，认为西瓜雄全同株受隐性单基因a控制[16]。Jiang和Lin认为隐性单基因gy控制西瓜全雌株性型[17]。本研究以浅绿色果皮雄全同株材料ZXG1555、绿色果皮雌雄异花同株材料COS为亲本，构建F2代群体及两组极端性状基因池（绿色-浅绿色果皮、单性花-两性花），结合BSA-seq与亲本重测序数据，利用InDel和CAPS标记对F2群体作基因分型，缩小定位区间，分析区间内基因，筛选并初步推测候选基因。

1 材料与方法

1.1 植物材料

母本（P1）为ZXG1555浅绿色果皮，雄全同株，雌花为两性花（由国家西甜瓜种质资源中期库提供）；父本（P2）为Cream of Saskatchewan（简称“COS”）绿色果皮，雌雄异花同株，雌花为单性花（由原美国农业部南部研究中心Angela R.Davis博士提供）。亲本杂交获得F1代，F1自交获得F2代。2021年春季，P1（15株）、P2（15株）、F1（15株）和F2（216株）植株在东北农业大学向阳试验示范基地种植；2021年秋季，播种200株F2于东北农业大学设施园艺工程中心育种温室内，全部采用随机区组试验设计播种，双蔓整枝。

1.2 表型调查与统计分析

授粉40～45 d后，收获P1、P2、F1和F2代果实，直接观察果皮表面颜色情况并拍照保存，统计果皮颜色分离情况，作卡方检验，明确果皮颜色性状在群体中遗传规律。

分别于2021年春秋两季晴天清晨对开放雌花作表型统计，记录每朵雌花上雄蕊数量，每株至少统计4朵雌花。根据Martínez等[18]定义的两性花指数（Andromonoecious index，AI值）对雌花计算AI值及分类，将无雄蕊发育的单性雌花定义为AI=1，雄蕊数为1和2或雄蕊不产生花粉的两性花AI=2，雄蕊数大于或等于3且产生花粉的两性花AI=3。计算分离群体中各单株AI平均值，AI＜1.2雌花为单性花，AI＞1.2雌花为非单性花。调查比例，使用Graphpad Prism 8.0绘制AI值在F2代群体中频率分布直方图。

1.3 BSA-seq及基因初步定位

1.3.1 DNA提取及BSA-seq分析

采集P1、P2、F1、F2代单株幼嫩叶片并存放于-80℃冰箱中，采用改良CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法提取基因组DNA，经1%琼脂糖凝胶电泳和DNA紫外分光光度计检验DNA质量和纯度。

于春季F2群体中选择绿色和浅绿色果皮单株各20株，提取基因组DNA，等量混合，建立绿色-浅绿色基因池；选择单性花（AI值为1）和两性花（AI值为3）各20株，提取基因组DNA等量混合，构建单性花-两性花基因池，将构建的基因池及亲本DNA样品送至深圳华大基因科技有限公司测序。于Illumina HiSeq XTen测序平台测序，作BSA-seq分析，亲本及各基因池测序深度为20×，以97103 V2为参考基因组（http://cucurbitgenomics.org/organism/21）。

1.3.2 分子标记开发

根据BSA-seq结果及亲本重测序数据，抽取亲本BSA-seq结果区间序列，查看区间内InDel变异，选择插入或缺失片段大于5 bp位点前后各500 bp序列，设计引物。对于定位区间内的SNP位点，选择位点上下游各500～700 bp序列，利用SNP2CAPS软件[19]及5种限制性内切酶（TaqI、EcoR I、BamH I、MspI、XhoI）筛选位于酶切位点处SNP突变，将其转化为CAPS标记，采用Primer Premier 5.0软件设计引物，引物序列由上海生工生物工程技术服务公司合成。

1.3.3 F2代群体基因分型与分子标记数据统计

利用亲本ZXG1555和COS及其F1代筛选具有共显性多态性分子标记，果皮颜色性状利用春季收获F2代进行基因分型；单性花性状分别对春秋两季F2代单株进行基因分型。PCR体系为1 μL DNA，上下游引物各0.5 μL，dNTP 0.5 μL，10×PCR buffer（含Mg2+）1 μL，Taq酶0.1 μL。PCR程序使用降落式PCR扩增，反应程序参照Amanullah等[20]。InDel标记PCR产物直接经8%聚丙烯酰胺凝胶在220 V、400 mA下电泳1 h，银染法显影；CAPS标记PCR产物使用相应限制性内切酶进行酶切反应后（TaqI在65℃下酶切，其他限制性内切酶均于37℃下反应3～4 h），1%琼脂糖凝胶电泳检验。

分子标记条带统计，与父本COS相同条带记为A，与母本ZXG1555相同条带记为B，含有双亲条带杂合类型单株记为H。使用Microsoft®Excel 2007统计带型，在表现为隐性性状单株中利用分子标记检测重组事件，缩短定位区间。

1.3.4 候选基因筛选

选择亲本COS及其他6份果皮绿色、单性花西瓜品种（W1-105、W1-92、W1-61、W1-17、W1-1、LSW-177）基因组测序数据与亲本ZXG1555（浅绿色果皮、两性花）基因组数据作对比，利用IGV（Integrative genomics viewer）软件分析两种性状定位区间内候选基因编码区（Coding sequence）序列变异情况，候选基因序列和氨基酸变异使用DNAMAN 6.0（美国Lynno Biosoft）软件作比对，筛选候选基因。

2 结果与分析

2.1 西瓜果皮颜色性状遗传分析

母本ZXG1555表现为浅绿色果皮，父本COS为绿色果皮，F1表现为绿色果皮，与父本一致，F2代群体中共产生绿色果皮和浅绿色果皮两种表型（见图1），其中绿色果皮为150株，浅绿色果皮37株，经卡方检验，符合3∶1遗传分离比例（χ2=2.71，P=0.10），上述结果表明，浅绿色果皮性状由单隐性基因调控。

图1 亲本P1、P2及F1、F2果皮性状表型Fig.1 Peel trait of P1,P2,and F1,F2

2.2 西瓜单性花性状遗传分析

母本ZXG1555（P1）雌花为两性花，父本COS（P2）雌花为单性花，F1表现为两性花，与ZXG1555相同，说明单性花为隐性性状。F2代分离群体中包含单性花和两性花，其中两性花中雄蕊数量由1～5个不等（见图2），计算每个单株AI值平均值作为表型数据，2021年春季调查获得有效数据单株为187株（见图3a），其中AI＞1.2（非单性花）植株数为129株，AI＜1.2（单性花）植株数为58株，通过卡方检验，符合3∶1（χ2=3.6，P=0.057）；2021年秋季共获得有效数据单株137株，其中AI＞1.2（非单性花）植株数为84株，AI＜1.2（单性花）植株数为53株（见图3b），单性花比例升高。由此初步推断，存在主效隐性基因调控西瓜单性花性状，且环境因素影响单性花形成。

图2 亲本P1、P2及F1、F2雌花性状表型Fig.2 Female flower trait of P1,P2,and F1,F2

图3 F2雌花AI值频率分布Fig.3 Frequency distribution of AI value of felame flower trait in F2

2.3 西瓜果皮关键基因定位与候选基因筛选

BSA-seq结果显示，在9号染色体上获得与果皮颜色连锁的染色体区段，物理距离为9 231 575～14 532 222 bp（约5.3 Mb）。在区间内设计40对In-Del引物，经筛选获得20对具有多态性分子标记，选择其中13个代表性分子标记，从2021年春季收获的187个F2代群体中对37株具有隐性性状（浅绿色果皮）单株进行基因分型，其中13个单株检测到重组事件，区间缩至12 625 472～13 732 411 bp，区间长度1.1 Mb（见图4）。

图4 西瓜果皮颜色基因定位结果Fig.4 Genetic mapping of rind color gene in watermelon

定位区间内共包含37个候选基因，利用两亲本及其他6份果皮均为绿色西瓜材料基因组重测序数据，检测37个候选基因中仅在浅绿色果皮ZXG1555中发生突变，利用DNAMAN软件分析突变是否造成氨基酸序列改变。结果表明，37个候选基因中，22个基因在编码区存在非同义突变（见表1）。通过葫芦科数据库及拟南芥官网（https://www.arabidopsis.org/）分析候选基因来源及代谢途径。经筛选初步推测Cla97C09G175170为浅绿色果皮性状候选基因，Cla97C09G175170编码Two-component response regulator-like protein APRR2，在西瓜及其他葫芦科作物中，认为APRR2基因与叶绿素代谢有关。本试验中，Cla97C09G175170编码区在ZXG1555中存在三处非同义突变，第585个碱基由G突变为A使第195位氨基酸由甲硫氨酸变为异亮氨酸；第595个碱基由A突变为C使第199个氨基酸由甲硫氨酸变为亮氨酸；第1496位碱基由C突变为T，该处氨基酸由脯氨酸变为异亮氨酸。

表1 西瓜果皮颜色区间内候选基因Table 1 Candidate genes of watermelon rind color

2.4 西瓜单性花关键基因定位与候选基因筛选

利用BSA-seq将控制西瓜单性花基因定位于3号染色体，物理位置为28 443 661～29 576 359 bp（约1.1 Mb），另向外扩充开发分子标记，区域长度共为2.51 Mb。在区间内设计10对InDel引物和24对CAPS引物，经多态性检测分别有3对和10对具有多态性。选择其中11个标记作基因分型。2021年春季187个植株中存在53个隐性单株，其中14株发生重组；秋季137个植株中存在51个隐性单株，其中9株发生重组，两季F2隐性单株定位分析均将区间缩至同一位置29 252 650～30 021 268 bp处，物理距离约为0.7 Mb（见图5）。

图5 西瓜单性花基因定位结果Fig.5 Genetic mapping of unisexual flower gene in watermelon

定位区间内共包括74个候选基因，利用本试验亲本和其他6种单性花西瓜材料重测序数据，与西瓜参考基因组（97103 V2）作比对，检测候选基因中仅存在ZXG1555突变，其中27个基因在编码区显示非同义突变（见表2）。使用葫芦科数据库和拟南芥官网查询候选基因相关信息，以拟南芥同源基因作为参考，在定位区间内存在基因Cla97C03G066110在西瓜基因组中功能注释为1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase 7，认为该基因参与植物体乙烯生物合成，在葫芦科作物性别分化过程中，乙烯发挥重要作用，故初步推测Cla97C03G066110可能为西瓜单性花性状候选基因。在Cla97C03G066110编码区内，ZXG1555发生两处非同义突变，第792位碱基由G突变为C，该处氨基酸由天冬氨酸变为赖氨酸；第1 185位碱基由C突变为G，氨基酸由亮氨酸变为苯丙氨酸。

表2 西瓜单性花区间内候选基因Table 2 Candidate genes of unisexual flower trait of watermelon

续表

3 讨论

3.1 西瓜浅绿色果皮定位及候选基因分析

西瓜果皮颜色是重要商品性状，对消费者选择具有直接影响，外皮分为果皮底色和条纹颜色。果皮底色包括深绿、绿色、浅绿、黄色等不同颜色，主要由内源色素比例决定，如叶绿素和类黄酮[21]。Park等研究西瓜果皮颜色深度，构建遗传连锁图谱，在8号染色体上发现一个与深绿色果皮连锁标记chr8_26061[9]。Kumar和Wehner认为浅绿色果皮受g-1和g-2共同调控，当两基因均为隐性时，果皮呈浅绿色，当其中任意一个以显性形式（G-1或G-2）单独存在或同时存在，则形成深绿色果皮[22]。Li等研究深绿、浅绿色果皮时，发现果皮颜色由8号染色体上ClCG08G017810控制，该基因编码Ubiquinone/menaquinone biosynthesis methyltransferase UbiE，编码区存在的非同义突变使氨基酸由精氨酸变为甘氨酸，导致西瓜果皮颜色存在差异[23]。与果皮颜色基因多被定位到8号染色体，本研究则将控制西瓜浅绿色果皮的基因定位于9号染色体，前人研究中以深绿和浅绿果皮为亲本，本研究以绿色和浅绿色为亲本，具有不同遗传背景，说明存在多个基因影响西瓜果皮颜色形成。分析定位区间内22个候选基因，推测Cla97C09G175170（APRR2）为调控西瓜浅绿色果皮候选基因。Oren等研究西瓜和甜瓜果皮发现，APRR2可能是致使两种作物中绿色和浅绿色外皮产生差异的关键基因[24]。故本研究初步推测Cla97C09G175170可能为控制浅绿色果皮性状候选基因。

3.2 西瓜单性花定位及候选基因分析

在常规育种中，单性花品种自然授粉结实率低，需人工授粉，两性花使自然授粉更容易，果实通常比单性花更圆[25]。葫芦科作物性别分化与乙烯高度相关，甜瓜、黄瓜和西葫芦中3个乙烯生物合成同源基因CmACS7[26]、CsACS2[27]和CpACS27A[18]发生突变使雌花在发育过程中产生雄蕊，生成两性花。使用乙烯利和硝酸银处理2叶1心西瓜，待植株长至4叶期，作qPCR分析，所有处理CitACS4表达水平均显著降低。喷洒乙烯利时产生两性花，是因外源喷施乙烯抑制内部乙烯形成，从而抑制子房发育；喷洒乙烯抑制剂硝酸银导致内部乙烯合成量减少，使西瓜仅诱导两性花[28]。李凤梅等开发CitACS4在甜瓜中同源基因CmACS7的CAPS分子标记，可用于对甜瓜单性花材料分子鉴定及辅助育种[29]。Manzano等研究西瓜CitACS4基因发现，该基因编码参与乙烯生物合成的花特异性ACS酶，基因编码区出现一个非同义突变，导致CitACS4蛋白364位氨基酸由半胱氨酸变为色氨酸，花芽中乙烯合成减少，雌花向两性花转变[6]。本试验初步推测3号染色体上Cla97C03G066110（CitACS4）为西瓜单性花形成候选基因。本研究中，CitACS4在ZXG1555发生两处非同义突变，使第264位氨基酸由天冬氨酸变为赖氨酸，第395位氨基酸由亮氨酸变为苯丙氨酸，可能导致雌花生长过程中部分功能丧失，乙烯合成减少，单性花转变为两性花。除受遗传因素影响外，光照强度、光周期和温度等环境因素也影响西瓜性别表达，本试验调查两季表型数据有差异，秋季单性花比例增加可能是受环境影响，秋季光照弱，太阳高度角低，温度光照分布不均匀，而短日、低光照强度和夜间温度低均促进雌花发育，从而产生更多单性花[30]。