张国卉 朱紫妍 慕沁汝 刘 谦

（山东中医药大学，山东济南 250355）

丹参为唇形科植物丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根和根茎[1]，是我国传统的大宗药材，历史悠久，药理活性广泛而复杂。丹参具有保护心肌、抗动脉粥样硬化、降低血压和抗炎等作用，常用于治疗心绞痛、冠心病、高血压和炎症等多种病症[2]。其中，主治心绞痛和冠心病的复方丹参滴丸更是有望成为全球首个通过FDA认证的复方中药[3]。目前，丹参在全国多地均有栽培且产区逐年扩大，但仍然面临原药材货源紧缺的风险，一方面是由于我国社会进入老龄化，心脑血管疾病的发病率不断攀升，且近些年发病趋于年轻化的程度更加严重[4]；另一方面是因为随着研究人员对其药理作用的深入研究，丹参的临床应用也有了更多新途径。这些因素的共同作用促使丹参市场需求量呈逐年扩增的态势。现今市售丹参基本为人工栽培品种，因产地环境不同，质量也参差不齐，加之近年玉米、大豆等价格上涨[5]，药农种植丹参的积极性不高，提高丹参产量与质量迫在眉睫。但是，丹参次生代谢机制尚不明确，品种选育年限过长等问题大大限制了新品种选育的进程，无法满足丹参生产多样化、精准化的需求。通过基因工程，可以辅助定向培育高产、高抗的优质新品种，或提高原药材次生代谢产物含量用于有效成分提取，以满足丹参巨大的市场需求量。1995年张荫麟等[6]首次利用基因工程中的农杆菌介导法，以不含目的基因的根癌农杆菌C58和发根农杆菌ATCC15834、LBA9402[7]对丹参无菌苗进行侵染，最终获得了丹参酮含量更高、根系更发达的再生植株。之后，相关研究人员在此基础上导入不同的目的基因，构建了各种丹参遗传转化体系，涌现出大批相关报道。现阶段，农杆菌介导法仍是进行丹参基因工程研究时使用的最普遍有效的手段。基于此，本文从转化原理、影响因素和研究现状三方面入手，对以农杆菌介导法为转化手段的丹参遗传转化体系建立进行综述，以期为今后丹参基因功能研究和新品种培育提供参考。

1 农杆菌介导丹参遗传转化体系研究的转化原理

1.1 农杆菌种类

农杆菌是根瘤菌科（Rhizobitaceae）农杆菌属（Agrobacterium）的革兰氏阴性细菌[8]，分为根癌农杆菌、发根农杆菌、放射性农杆菌和旋钩子农杆菌。在丹参遗传转化研究中，常用的是根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）。

根癌农杆菌和发根农杆菌中均具有一个环状DNA，分别称为Ti质粒和Ri质粒，研究人员根据质粒诱导合成的冠瘿碱不同对其进行分类。在侵染丹参的试验中，常用的根癌农杆菌为章鱼碱型、胭脂碱型和农杆碱型，常用的发根农杆菌为甘露碱型、农杆碱型和黄瓜碱型。外植体经根癌农杆菌侵染后可诱发产生冠瘿瘤，经发根农杆菌侵染后则产生大量不定根，在一定激素的诱导下可以再生成完整植株。

1.2 农杆菌介导法的转化原理

Ti质粒和Ri质粒结构相似，主要包括Ori复制起始区、Vir毒性蛋白区和T-DNA区3个功能区，这决定了它们具有相似的转移机制。以下以Ti质粒为例介绍农杆菌的转化原理。

野生型Ti质粒中有一段携带致瘤基因的TDNA序列，在Vir毒性区的作用下可被转移插入到植物DNA组中完成植物的转基因过程。具体可分为4步：①植物受伤后，伤口部位释放的酚类物质吸引农杆菌靠近；②农杆菌细胞膜上的VirA蛋白结合信号物质并通过磷酸化突进，进一步激活另一个蛋白VirG；③核酸内切酶VirD1和VirD2受到激活态的VirG蛋白诱导后，在T-DNA末端长为25个碱基的重复序列位置进行切割，产生一条在一端结合VirD2蛋白的单链T-DNA[9]；④VirE2蛋白与新产生的TDNA链结合形成成熟的T-DNA复合体进入植物细胞，在植物细胞核中，T-DNA通过一系列作用被整合到植物基因组上。

但是，在实际的转基因过程中，野生型Ti质粒往往无法直接使用，主要是由于其上没有合适的筛选标记、缺乏直接为人所用的有效酶切位点、携带的致瘤基因太大且与研究不相关等。因此，研究人员通常会将T-DNA放置到另一个更容易被操作的载体上，而位于识别序列之间的DNA则被替换为要研究的目的基因，通过侵染，致病系统诱导T-DNA进入植物细胞但不引入任何致瘤基因，从而使目的基因整合到植物基因组上，且不产生冠瘿瘤。

2 丹参遗传转化体系建立过程中影响转化的因素

2.1 外植体选择

外植体种类是影响丹参转化效率的重要因素。这是由于农杆菌中T-DNA转移到植物细胞完成转化的阶段在短时间内发生，要求植物细胞具有较强的分裂能力；而对于器官完整的植株来说，不同器官的不同部位分裂能力有差异。因此，外植体选取的部位不同，最终导致转化效率不同。

目前，在以丹参为供试材料的试验中，主要将叶片作为外植体。在同一条件下，用发根农杆菌侵染丹参的叶片、叶柄和茎段，叶片的诱导效率最高，是最适合进行毛状根诱导的外植体[10-11]。尤其是叶片基部，因叶脉更粗，对农杆菌的侵染更加敏感，是叶片中转化率最高的部位[12]。蔡 媛等[13]对丹参叶片大小进行了筛选，结果表明，1.0～1.2 cm2为最佳叶面积，考虑到实际操作的便利性，最终将最佳条件确定为0.8 cm2。但也有少数试验结果表明，叶柄的分化率更高，分化速度更快，较叶片和茎段有明显优势，具体可能与丹参叶龄有关。当丹参叶龄为7～14 d时，叶片分化效率较高；当叶龄超过14～28 d甚至更长时，叶柄分化效率较高[14]。由此可见，在选用外植体时还需考虑丹参叶龄。

2.2 外植体预培养时间

适宜的预培养处理对丹参转化率的提高具有促进作用。外植体之所以需要预培养，有3个方面的原因：一是外植体刚从植株上分离，需要进行生理状态调整，从而加快细胞分裂，提高转化效率；二是在植物伤口愈合过程中，细胞需要一定时间完成酚类化合物等信号分子的产生与释放，从而诱导农杆菌完成转化；三是在剪切外植体的过程中可能会对其造成污染，通过预培养可提前剔除被杂菌污染的外植体。

预培养时间通常不超过3 d，以1～2 d居多。王丽娟[15]设置预培养时间为 1、2、3、4 d，并以未经预培养的丹参叶片切块为对照进行试验，发现预培养1 d或2 d的外植体转化效率较高。若预培养时间过长，植物细胞伤口基本愈合开始形成愈伤组织或不定芽，农杆菌侵染将较为困难，不仅会导致转化率大大降低，同时还会提高假阳性概率。

2.3 菌株种类

选用的菌株种类不同往往会对转化过程产生直接影响。LBA4404、GV3101和EHA105是构建丹参遗传转化体系时常用的根癌农杆菌，其中GV3101和EHA105的使用率更高，且EHA105生长迅速、转化操作简单，为转化试验中的首选菌种。常用的发根农杆菌种类更为多样。周 伟等[10]采用C58C1、R1601、A4进行丹参毛状根诱导率比较，结果表明，C58C1＞R1601＞A4， 且 C58C1的诱导率远大于 A4；谈荣慧等[16]利用发根农杆菌 LBA9402、A4、15834在pH值为4.81的MSOH液体培养基中培养丹参毛状根，发现其丹酚酸含量具有明显差异，由LBA9402和A4诱导的毛状根丹酚酸含量较高，15834诱导的毛状根丹酚酸含量最低。

2.4 菌液浓度、侵染时间和共培养时间

菌液浓度、侵染时间和共培养时间是限制转化率的关键因素，试验过程中三者经常作为组合条件一同考虑。原因是农杆菌侵染外植体后通常需要在创口部位生存16 h，从而将携带的目的基因整合到被侵染的样品中，研究人员多采用农杆菌和外植体在培养基上共培养的方式实现目的基因到植物细胞的转移，其时间长短将直接影响转化效率的高低。若共培养时间过长，外植体会因农杆菌过度繁殖而腐化死亡；若共培养时间过短，则无法完成目的基因的整合。其最优时间的确定需要根据菌液浓度和侵染时间综合而定。因此，三者息息相关。在以丹参为外植体进行遗传转化研究的多篇文献中，均提到了菌液浓度、侵染时间和共培养时间的筛选（表1）。

表1 丹参不同遗传转化体系优化结果

分析前人研究成果可知，虽然在丹参不同转化体系的构建过程中得到的最优结果有所差异，但菌液浓度基本维持在OD600=0.2～1.0，侵染时间控制在5～30 min，共培养时间为 1～4 d。 若低于常用范围，农杆菌难以附着并完成转化；若高于常用范围，丹参外植体可能因为表面农杆菌过多难以剔除，最终受到毒害褐化，甚至死亡。

2.5 是否添加乙酰丁香酮

外源酚类化合物的添加可能会促进丹参转化率的提高。在以其他药用植物为供试材料进行农杆菌转化的试验中证实，植物受伤后产生的酚类物质能够激活vir基因，促使Ti/Ri质粒向植物细胞转移，如黄伟剑等[18]在诱导广藿香外植体产生毛状根时，人为添加了质量浓度为15 mg/L的乙酰丁香酮，所用的2种不同菌株均表现出转化率的显著提高。因此，推测通过人为添加乙酰丁香酮提高转化效率的方式也可应用到丹参的转化试验中。

周 伟等[10]用发根农杆菌C58C1侵染外植体时，在预培养和共培养阶段均加入了400 μmol/L乙酰丁香酮，其转化率是不添加乙酰丁香酮时的1.55倍；超过最佳浓度后，丹参外植体会因高浓度小分子酚类物质产生的氧化伤害褐化或老化死亡。但是，也有其他研究人员验证后表明，在一定情况下乙酰丁香酮并不是影响转化率的限制性因素，可能是因为丹参受伤时自然分泌的信号物质已足以诱导农杆菌中vir基因的活化[15]。

目前，有关乙酰丁香酮对农杆菌介导的丹参遗传转化体系的影响研究较少，试验结论的对立具体是因为各菌株类型对酚类化合物的敏感程度不同，还是因为操作过程中各条件的差异，仍需进一步研究。

2.6 除菌抗生素的添加

不同浓度和种类的除菌抗生素可以通过影响农杆菌生长及外植体分化间接影响转化效率。目前，在构建丹参遗传转化体系过程中常用的除菌抗生素有3种类型：头孢霉素、羧苄青霉素、特美汀。试验证明，这3种抗生素都能够起到抑制农杆菌生长的作用。在头孢霉素浓度低于400 mg/L时，丹参外植体会被过度繁殖的农杆菌污染；当头孢霉素浓度达到400 mg/L时，虽能有效抑制农杆菌生长，但也抑制了外植体分化，出芽率较低。与头孢霉素相比，羧苄青霉素和特美汀更适用于丹参外植体的脱菌，尤其是特美汀，在浓度达到400 mg/L后不仅有较好的除菌效果，同时丹参出芽率和转化率也是三者中最高的；用羧苄青霉素除菌时，丹参转化率随其浓度的增大而升高，400 mg/L为最佳浓度[19]。

因此，综合考虑除菌效果、外植体分化效果和转化率三方面，特美汀是最适宜丹参外植体除菌的抗生素，其次是羧苄青霉素，头孢霉素的效果最差。

3 研究现状

自以丹参为供试材料实现了目的基因的转入后，更多研究人员将研究重心转移到利用农杆菌介导法提高丹参品质和产量上，且随着研究的不断深入，此法不仅可作为引入外源基因获得具有优良性状丹参植株的利器，还逐渐成为探究丹参中影响有效成分含量的关键基因功能和辅助其他生物技术发挥作用的重要手段，近几年发展势头尤为迅猛。

3.1 引入外源基因培育高抗丹参

3.1.1 抗旱丹参的培育。Zhang等[20]在CaMV 35S启动子控制下，利用农杆菌介导法将从红景天中分离得到的GPX基因家族成员RcGPX5在丹参中进行表达，与野生型相比，在干旱胁迫下转基因丹参幼苗的枯萎时间更晚，丹参对干旱胁迫的耐受性增强。

3.1.2 抗除草剂丹参的培育。Liu等[21]将bar基因作为目的基因，通过农杆菌导入到丹参中，并采用抗除草剂和gus表达两步法进行筛选，最终获得的阳性植株经Basta喷洒后，表现出对除草剂较强的耐受性，成功获得了抗除草剂的丹参品种。

3.2 探究与丹参有效成分含量提高相关的基因功能

通过与原植株对比，分析农杆菌转化成功后的过表达株系中有效成分含量变化水平，可以证明目的基因是否具有直接促进次生代谢产物合成的功能。如张建红等[22]通过农杆菌介导法获得了丹参中SmCYP81C16基因的过表达转基因毛状根株系，经过与对照株系比较发现，在SmCYP81C16过表达阳性株系中，丹参酮类化合物的含量升高，且过表达毛状根中丹参酮合成途径关键酶基因的表达量也显著上升。由此证明，SmCYP81C16具有正向调控丹参酮生物合成的功能。

除此之外，农杆菌介导法还可作为探明部分基因如何间接影响有效成分含量的辅助手段。Wu等[23]利用农杆菌介导法成功获得了过表达AtPAP1基因和过表达SmbHLH51基因的丹参植株，在此基础上经过进一步的分析和验证得出，AtPAP1通过激活SmbHLH51的表达来刺激丹参酚酸的合成，并可能与SmbHLH51形成潜在的转录复合物，明确了AtPAP1转录因子促进丹参酚酸产生的分子机制。

3.3 证明其他生物技术用于提高丹参品质的可行性

Zhou等[24]先利用CRISPR/Cas9系统对筛选出的RAS基因进行特异性编辑，再将编辑好的目的基因用农杆菌介导的方式导入丹参细胞中，最终在转基因毛状根中观察到了酚酸水平的变化，验证了CRISPR/Cas9系统作为丹参甚至药用植物基因组修饰工具的可行性。

4 结语

丹参是常用中药材，同时丹参基因组小、染色体少，在转基因再生植株时世代周期较短，作为药用模式植物有着极高的研究价值[25]。根是植物进行次生代谢最活跃的部分，而包括丹参在内的大部分药用植物有效成分都是次生代谢产物。由发根农杆菌诱导产生的毛状根来源于同一个植物细胞，每个毛状根细胞都是转化的，不会产生转化细胞与非转化细胞的嵌合体，遗传稳定性好；且由毛状根再生出的植株大多节间短、顶端优势较弱，有利于转化植株的筛选，在作为生物反应器和改良丹参品质方面具有很大的市场和潜力。近几年，以发根农杆菌介导法为转化手段得出的试验成果逐渐增多，但相比于根癌农杆菌，由发根农杆菌介导的丹参遗传转化体系还不够成熟，部分与转化效率有关的影响因素有待进一步优化。相信随着农杆菌转化技术的日臻成熟，定会在优化和丰富丹参种质资源方面实现质的飞跃。