沈凌筠，李莉，王戈，曾海燕，骆鹏举，朱兴玉

（1.云南省传染性疾病临床医学中心/昆明市第三人民医院，云南 昆明 650000；2.昆明医科大学基础医学院，云南 昆明 650000）

结核分枝杆菌作为一种寄生菌，在机体中不能单独存活，需寄生在细胞内，当侵染肺脏时，可造成患者胸闷气短、喘息咳嗽、低热盗汗、消瘦乏力等症状，胸片上可见结核空洞或斑片状阴影，极大影响患者正常工作、生活[1-3]。结核分枝杆菌进入肺脏，寄生在巨噬细胞中，可导致其凋亡，释放出寄居的结核杆菌，增强肺部感染。结核分枝杆菌还能激活周围未被寄生的巨噬细胞，促进氧自由基及多种炎症因子产生，引发肺组织炎症与过氧化损伤，使巨噬细胞凋亡进一步增强，加重肺损伤，因而降低巨噬细胞凋亡对肺结核的防治至关重要[4-5]。香菇多糖是自香菇子实体中分离出的一种葡聚糖，具有明显的抗真菌、抗细菌、抗病毒等作用，能明显抑制脂多糖刺激的NLRP3炎性信号激活，下调凋亡蛋白表达，抑制肠上皮细胞凋亡，缓解肠道损伤，还可显著降低非小细胞肺癌合并肺结核患者血清炎症因子水平，增强其机体免疫力，提高疗效[6-7]。由此可推测，香菇多糖可能抑制肺结核大鼠巨噬细胞的凋亡。miR-221是诊断结核病的一种生物标志物，参与介导肺结核、急性肺损伤等肺部疾病的发病过程，降低miR-221的表达，可显著减轻脂多糖诱导的肺部炎症，抑制肺细胞凋亡，改善肺组织损伤[8-9]。因此，miR-221可作为缓解肺结核大鼠巨噬细胞凋亡的潜在作用靶点。本研究以尾静脉注射结核分枝杆菌悬液的方法建立肺结核大鼠模型，探讨香菇多糖通过调控miR-221表达对肺结核大鼠巨噬细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6～8周龄SPF级雄性SD大鼠72只，体质量190～210 g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，动物生产许可证号：SCXK（鲁）2019-0003，在通风良好的动物房中饲养，温度设为25 ℃、湿度设为54%，照明以12 h/12 h明暗交替循环，大鼠自由饮水进食。本实验经本院动物伦理委员会批准，在实验过程中严格遵循3R原则。

1.2 药物与试剂 结核分枝杆菌H37Rv（批号：19080311）购自中国药品与生物制品鉴定所；分枝杆菌即用型液体培养基（批号：GOMY0019）购自上海晶诺生物科技有限公司；香菇多糖（HPLC≥98%，批号：XY24117）购自上海信裕生物科技有限公司；含琼脂斜面培养基（批号：SY0498）购自北京伊塔生物科技有限公司；DMEM（含双抗）培养基（批号：12100）、活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）检测试剂盒（批号：CA1410）、ANNEXIN V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒（批号：CA1020）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量检测试剂盒（批号：BC0025）、总RNA提取试剂盒（批号：R1200）、HE染色试剂盒（批号：G1120）、一步法实时荧光定量试剂盒（批号：T2210）、高效RIPA裂解液（批号：R0010）、大鼠白细胞介素-17（Interleukin-17，IL-17）检测试剂盒（批号：SEKR-0007）、大鼠白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）检测试剂盒（批号：SEKR-0005）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号：PC0020）均购自北京索莱宝科技有限公司；兔源Anti-Caspase-9一抗（批号：ab185719）、兔源Anti-GAPDH一抗（批号：ab181602）、兔源Anti-Bax一抗（批号：ab32503）、羊抗兔二抗（批号：ab150077）均购自美国Abcam公司。

1.3 主要仪器 ZX-400型全自动菌落计数仪（杭州泽析生物科技有限公司）；XElx800型酶标仪（珀金埃尔默企业管理有限公司）；ASP300S型全封闭式组织脱水机、RM2035型轮转切片机、EG1160型包埋机、DCM8型光学显微镜均购自德国Leica公司；ZE5型流式细胞仪、1659001型蛋白电泳仪、CFX96型实时荧光定量PCR仪、Trans-Blot Turbo型蛋白转印系统、ChemiDoc XRS型凝胶成像仪均购自美国Bio-Rad公司。

1.4 造模与分组 参照文献[10]制备肺结核模型大鼠，将购买的结核分枝杆菌置于0.9%NaCl溶液中，制备细菌悬液，接种在液体培养基中，于37.5 ℃条件下培养5周，离心得到细菌沉淀，以0.9%NaCl溶液制备成质量浓度5 mg/mL的悬液，尾静脉注射0.2 mL构建肺结核模型大鼠。病理组织切片观察肺部组织有明显的干酪样坏死、液化灶等病变提示造模成功。将造模成功大鼠随机分为模型组、miR-221 agomir阴性对照组、miR-221 agomir组、香菇多糖组、香菇多糖+miR-221 agomir组，每组12只，另选12只SD大鼠作为对照组，尾静脉注射0.9%NaCl溶液0.2 mL。

1.5 实验给药 香菇多糖溶于0.9%NaCl溶液，配制为5 mg/mL的香菇多糖[11]药液，香菇多糖+miR-221 agomir组大鼠参照miR-221 agomir说明书及文献[9]尾静脉注射2 mg/kg的miR-221 agomir（2次/周），同时灌胃10 mL/kg的香菇多糖药液（1次/d）；香菇多糖组大鼠灌胃10 mL/kg的香菇多糖药液（1次/d），同时尾静脉注射（与miR-221 agomir组相同的方法）等量0.9%NaCl溶液（2次/周）；miR-221 agomir组、miR-221 agomir阴性对照组大鼠分别尾静脉注射miR-221 agomir、miR-221 agomir阴性对照，2 mg/kg，2次/周，同时灌胃10 mL/kg的0.9%NaCl溶液（1次/d）；对照组、模型组大鼠灌胃10 mL/kg的0.9%NaCl溶液（1次/d），同时尾静脉注射（与miR-221 agomir组相同的方法）等量0.9%NaCl溶液（2次/周）。各组大鼠均给药干预2周。

1.6 观察指标

1.6.1 大鼠结核分枝杆菌菌落计数及收集标本 各组大鼠于给药结束后24h，以乙醚气体进行麻醉，从腹主动脉吸出血液1.5mL，4 ℃下3 000 r/min离心15 min，吸出上清，保存在-80 ℃冰箱。各组随机选出6只大鼠断头处死，开腹取出双肺，以蒸馏水漂洗左肺，进行脱水、透明、包埋、切片后，得到厚约4 μm的肺组织薄片备用；剪下右肺组织1.2 g（分为0.4 g和0.8 g的两块），保存在液氮中；再次剪下右肺组织1.0 g，加入适量0.9%NaCl溶液后以硫酸消化，接种在斜面培养基中，37.5 ℃条件下培养5周，采用全自动菌落计数仪计数培养基上菌落数。

1.6.2 大鼠肺泡巨噬细胞凋亡检测 收集支气管肺泡巨噬细胞：选1只未做处理的大鼠，以乙醚麻醉后切开气管，采用注射器吸取5 mL 0.9%NaCl溶液注入肺组织，收集肺泡灌洗液，重复3次，得到的灌洗液于4 ℃下800 r/min离心15 min，以PBS缓冲液洗涤细胞沉淀3次后，加入适量DMEM培养基重悬细胞，通过台盼蓝染色检测细胞存活情况，活细胞＞90%，表明大鼠肺泡巨噬细胞收集成功。

肺泡巨噬细胞凋亡检测：按照上述方法收集各组剩余的6只大鼠肺泡巨噬细胞，得到细胞沉淀后，以PBS缓冲液重悬，参照试剂盒说明指导步骤，加入适量ArmexinV-FITC与PI，避光孵育10min，上样到流式细胞仪中，检测肺泡巨噬细胞凋亡情况。

1.6.3 大鼠肺组织病理变化检测 取出“1.6.1”中的肺组织切片，做脱蜡、水化处理后，参照试剂盒说明指导步骤，进行HE染色，以“1.6.1”中方法再次脱水、透明后封片，在光学显微镜下观察着色情况，评测各组大鼠肺组织病理形态，任意选出5个视野，收集其图像。

1.6.4 大鼠肺组织ROS、MDA水平与血清IL-6、IL-17水平 取“1.6.1”中冻存在液氮中的0.8 g肺组织，剪为小碎块后置于适量高效RIPA裂解液中，匀浆后4 ℃下3 000 r/min离心25 min，吸出上清，取出0.12 mL，使用试剂盒参照其说明指导步骤，测量其中ROS、MDA水平。

取“1.6.1”中冻存在-80 ℃的血清提前以冰水浴解冻，使用试剂盒参照其说明指导步骤，测量其中IL-6、IL-17水平。

1.6.5 qRT-PCR法测定各组大鼠肺组织miR-221表达水平 取“1.6.1”中冻存在液氮中的0.8 g肺组织，剪为小碎块后，以试剂盒参照其说明指导步骤，提取总RNA后进行实时荧光定量PCR反应，以U6作为miR-221的内参基因，所得Ct值通过2-ΔΔCt算法进行分析，得到miR-221的相对表达量。miR-221、U6基因引物序列见表1。

表1 各基因引物序列

1.6.6 免疫印记法检测各组大鼠肺组织凋亡蛋白Caspase-9、Bax表达水平 取“1.6.4”中剩余的肺组织蛋白样品液，使用试剂盒通过BCA法，参照其说明指导步骤测出蛋白浓度后调至各组相同，电泳（120 V，75 min）分离蛋白，湿转（40 mA，60 min）转移蛋白至硝酸纤维膜上，将膜置于5%脱脂奶粉溶液中封闭（37 ℃，2 h），剪下目的蛋白条带，分别以兔源Anti-Caspase-9一抗、兔源Anti-GAPDH一抗、兔源Anti-Bax一抗孵育（4 ℃，11 h），TBST漂洗3次（5 min/次）后，使用羊抗兔二抗孵育（37 ℃，1.5 h），TBST漂洗3次（5 min/次）后，通过增强化学发光法对蛋白条带显色，采用凝胶成像仪拍照后以Image Lab软件定量其灰度值，经统计分析后得出各组蛋白相对表达。

1.7 统计学方法 运用SPSS 24.0软件进行统计分析，计量资料以“均数±标准差”（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较行LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肺组织结核分枝杆菌菌落数比较 与对照组比较，模型组、miR-221 agomir阴性对照组大鼠肺组织结核分枝杆菌菌落数明显升高（P＜0.05）；与模型组、miR-221 agomir阴性对照组、香菇多糖+miR-221 agomir组比较，香菇多糖组大鼠肺组织结核分枝杆菌菌落数明显降低（P＜0.05），miR-221 agomir组大鼠肺组织结核分枝杆菌菌落数明显升高（P＜0.05）；miR-221 agomir阴性对照组大鼠肺组织结核分枝杆菌菌落数与香菇多糖+miR-221 agomir组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表2）

表2 各组大鼠肺组织结核分枝杆菌菌落数比较（）

表2 各组大鼠肺组织结核分枝杆菌菌落数比较（）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与香菇多糖+miR-221 agomir组比较，cP＜0.05

2.2 各组大鼠肺组织病理形态改变情况 对照组大鼠肺组织结构形态无病理变化；模型组、miR-221 agomir阴性对照组大鼠肺组织结构形态破坏严重，出现大量结核结节，肺间质水肿且炎症细胞浸润明显，肺泡结构变形，可见坏死细胞脱落；与模型组、miR-221 agomir阴性对照组、香菇多糖+miR-221 agomir组比较，香菇多糖组大鼠肺组织上述病理损伤均明显减轻，miR-221 agomir组大鼠肺组织上述病理损伤均明显加重；与模型组比较，miR-221 agomir阴性对照组大鼠肺组织上述病理损伤无明显改变。（见图1）

图1 各组大鼠肺组织病理变化（HE，×200）

2.3 各组大鼠肺泡巨噬细胞凋亡情况比较 与对照组比较，模型组、miR-221 agomir阴性对照组大鼠肺泡巨噬细胞凋亡率均明显升高（P＜0.05）；与模型组、miR-221 agomir阴性对照组、香菇多糖+miR-221 agomir组比较，香菇多糖组大鼠肺泡巨噬细胞凋亡率明显降低（P＜0.05），miR-221 agomir组大鼠肺泡巨噬细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）；miR-221 agomir阴性对照组大鼠肺泡巨噬细胞凋亡率与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见图2、表3）

表3 各组大鼠肺泡巨噬细胞凋亡率比较（）

表3 各组大鼠肺泡巨噬细胞凋亡率比较（）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与香菇多糖+miR-221 agomir组比较，cP＜0.05

图2 各组大鼠肺泡巨噬细胞凋亡情况

2.4 各组大鼠肺组织过氧化水平比较 与对照组比较，模型组、miR-221 agomir阴性对照组大鼠肺组织ROS、MDA水平均明显升高（P＜0.05）；与模型组、miR-221 agomir阴性对照组、香菇多糖+miR-221 agomir组比较，香菇多糖组大鼠肺组织ROS、MDA水平明显降低（P＜0.05），miR-221 agomir组大鼠肺组织ROS、MDA水平明显升高（P＜0.05）；miR-221 agomir阴性对照组大鼠肺组织ROS、MDA水平与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表4）

表4 各组大鼠肺组织ROS、MDA 水平比较（）

表4 各组大鼠肺组织ROS、MDA 水平比较（）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与香菇多糖+miR-221 agomir组比较，cP＜0.05

2.5 各组大鼠血清炎症因子IL-6、IL-17水平比较 与对照组比较，模型组、miR-221 agomir阴性对照组大鼠血清IL-6、IL-17水平均明显升高（P＜0.05）；与模型组、miR-221 agomir阴性对照组、香菇多糖+miR-221 agomir组比较，香菇多糖组大鼠血清IL-6、IL-17水平明显降低（P＜0.05），miR-221 agomir组大鼠血清IL-6、IL-17水平明显升高（P＜0.05）；miR-221 agomir阴性对照组大鼠血清IL-6、IL-17水平与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表5）

表5 各组大鼠血清炎症因子IL-6、IL-17 水平比较（，pg/mL）

表5 各组大鼠血清炎症因子IL-6、IL-17 水平比较（，pg/mL）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与香菇多糖+miR-221 agomir组比较，cP＜0.05

2.6 各组大鼠肺组织miR-221及凋亡蛋白表达水平比较 与对照组比较，模型组、miR-221 agomir阴性对照组大鼠肺组织miR-221及凋亡蛋白Caspase-9、Bax表达水平均明显升高（P＜0.05）；与模型组、miR-221 agomir阴性对照组、香菇多糖+miR-221 agomir组比较，香菇多糖组大鼠肺组织miR-221及凋亡蛋白Caspase-9、Bax表达水平明显降低（P＜0.05），miR-221 agomir组大鼠肺组织miR-221及凋亡蛋白Caspase-9、Bax表达水平明显升高（P＜0.05）；miR-221 agomir阴性对照组大鼠肺组织miR-221及凋亡蛋白Caspase-9、Bax表达水平与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见图3、表6～7）

图3 各组大鼠肺组织凋亡蛋白Caspase-9、Bax 表达Western blotting图

表6 各组大鼠肺组织miR-221 表达水平比较（）

表6 各组大鼠肺组织miR-221 表达水平比较（）

表7 各组大鼠肺组织凋亡蛋白Caspase-9、Bax 表达水平比较（）

表7 各组大鼠肺组织凋亡蛋白Caspase-9、Bax 表达水平比较（）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与香菇多糖+miR-221 agomir组比较，cP＜0.05

3 讨论

相比其他众多感染性疾病，结核病的致死率更高。近年来，我国肺结核发病率有所上升，已成为死亡率最高的传染性疾病之一，是亟需解决的重要公共卫生问题[12-13]。在肺结核的发生及病情进展过程中，巨噬细胞发挥着关键作用，巨噬细胞可识别结核分枝杆菌，激活机体免疫，进而对其进行杀灭。寄生感染肺部巨噬细胞时，可极大促使巨噬细胞凋亡，不仅释放出大量结核分枝杆菌，造成扩散感染，还可进一步激活巨噬细胞，促进炎症与过氧化反应发生发展，加重肺组织病理损伤，因而抑制巨噬细胞凋亡，对于结核分枝杆菌的清除及肺结核的防治意义重大[4-5,14-15]。本研究通过尾静脉注射结核分枝杆菌悬液诱导建立肺结核大鼠模型，结果显示，大鼠在注射后，其肺组织结构形态遭到严重破坏，出现大量结核结节，肺间质水肿且炎症细胞浸润明显，肺泡结构变形，可见坏死细胞脱落。肺组织中结核分枝杆菌菌落数、巨噬细胞凋亡率、肺组织ROS与MDA水平、血清炎症因子IL-6与IL-17水平、肺组织凋亡蛋白Caspase-9、Bax表达水平均明显升高，表明结核分枝杆菌可在肺脏中大量增殖扩散，促使肺组织中巨噬细胞凋亡，诱导ROS和促炎因子过量释放表达，引发强烈的炎症与过氧化反应，造成严重的肺组织损伤。

香菇多糖是一种具有明显抗菌消炎作用的天然产物，可通过下调NLRP3蛋白表达抑制脂多糖引发的肠组织细胞凋亡，保护肠道功能，减少小细胞肺癌合并肺结核患者炎症因子表达，改善其临床症状，还可降低弓形虫感染引发的氧化应激水平，减轻严重的炎症反应，增强巨噬细胞增殖和吞噬能力，提升其免疫力，控制感染性疾病进展[6-7,16-17]。本研究以香菇多糖处理肺结核模型大鼠，可明显减轻其肺组织病理损伤，降低结核分枝杆菌菌落数、巨噬细胞凋亡率、肺组织ROS与MDA水平、血清炎症因子IL-6与IL-17水平、肺组织凋亡蛋白Caspase-9、Bax表达水平，表明香菇多糖可抑制结核分枝杆菌在肺组织中的增殖，减轻巨噬细胞凋亡，减弱结核分枝杆菌感染引发的炎症及氧化应激反应，缓解肺损伤，证实了香菇多糖可抑制巨噬细胞凋亡，发挥抗结核功能。

miR-221是抑制调控炎症的微小RNA，在肺结核、急性呼吸窘迫综合征、哮喘、呼吸道感染等肺脏疾病的发生及进展过程中起到重要调控作用。下调其表达，可降低炎症细胞因子表达，控制炎症发生发展，减轻脂多糖诱导的肺组织损伤，并抑制支气管上皮细胞凋亡，改善哮喘症状，缓解肺炎支原体引起的肺部感染[8,18-20]，因而，miR-221是防治肺结核的重要作用靶点。本研究结果显示，miR-221在肺结核模型大鼠肺组织中过表达，以miR-221 agomir上调其表达，可加重大鼠肺组织损伤，升高结核分枝杆菌菌落数、巨噬细胞凋亡率、肺组织ROS与MDA水平、血清炎症因子IL-6与IL-17水平、肺组织凋亡蛋白Caspase-9、Bax表达水平，表明miR-221能介导肺结核大鼠发病过程，促使其病情进展及巨噬细胞凋亡。miR-221 agomir可几乎完全抵消香菇多糖的抗巨噬细胞凋亡作用，并逆转其抗结核作用，表明香菇多糖能通过下调miR-221表达来减轻结核分枝杆菌感染引发的肺组织严重及过氧化损伤，并抑制巨噬细胞凋亡。

综上所述，香菇多糖可减少ROS与致炎细胞因子释放，抑制结核分枝杆菌感染引发的炎症及过氧化反应，减弱巨噬细胞凋亡，发挥抗结核病功效，且下调miR-221表达是其分子机制之一。本研究为香菇多糖的抗结核临床应用提供了实验依据，为结核病患者带来了更多的治疗策略。