李郁茹，赵亚芳，陈玉民，常闰然，田雨，张盈，罗娟，孔慧，赵琰，屈会化

（1.北京中医药大学中药学院，北京 100029；2.北京中医药大学中医学院，北京 100029；3.北京中医药大学中医药研究院，北京 100029）

肝脏是许多生理过程的关键枢纽，具有代谢、解毒和造血等多种重要的功能[1]。当发生损伤时，为了保障人体功能的正常运行，需要快速有效地修复该器官的损伤。急性肝损伤（acute liver injury，ALI）通常由病毒或细菌感染、化学毒物、药物中毒、给药不当等原因引起[2]，临床表现为急性肝功能障碍[3-4]。若不能及时清除病因或给予适当的药物治疗，可继而发展为急性肝性脑病[4]，该病具有预后差、死亡率高等特点[5]。临床上用于预防和治疗肝脏疾病的药物多为化学合成药物，如皮质类固醇、干扰素等。这些药物存在价格高、不良反应大等问题[4,6]。因此，开发一种安全、有效的防治急性肝损伤的药物具有重大意义。

纳米颗粒（nanoparticles）为现今研究的热点之一。碳点是纳米颗粒中一类粒径在1～10 nm之间的类球形颗粒，因具有高水溶性、低毒性、良好的生物相容性[7]等特点，其在药物传送[8]、荧光探针[9]、生物成像[10]、抗菌[11]和抗病毒[12]等诸多领域中广泛应用。碳点的制备方法“高温热解法”与炭药的制备方法“高温炭化法”有异曲同工之妙。基于此，本团队将纳米研究技术和方法引入到中药炭药的研究中并从多种炭药中分离出了类似于碳点的物质，将其命名为“纳米类成分（nanocomponents）”。进一步的研究发现，不同炭源和制备条件所制备出的纳米类成分由于粒径、官能团等性质的差异而具有不同的生物活性，如石榴皮炭纳米类成分具有止泻作用[13]，甘草炭纳米类成分具有抗应激性胃溃疡作用[14]，牡丹皮炭纳米类成分具有凉血止血作用[15]，枳实炭纳米类成分具有抗痛风作用[16]等。这为中药炭药的研究提供了一种全新的思路。

射干（Belamcandae Rhizoma，BR），为鸢尾科射干属植物射干Belamcanda chinensis (L.)DC.的干燥根茎，始载于《神农本草经》[17]。射干的烧制最早载于《金匮要略》鳖甲煎丸方，用以治疗癥瘕积聚、久疟疟母等疾病[18]。经文献考证，仲景时期的“烧”实则为“烧灰存性”[19]。“烧灰存性”为中药制炭的第一个炮制质量标准[20]。鳖甲煎丸条文中记载的射干“烧”实则为射干炭。现代研究表明，鳖甲煎丸在临床上常用于肝炎、肝纤维化、肝癌等肝系疾病的治疗[21]。为了探索原方中射干的炮制内涵，本研究基于前期的研究基础，首次利用射干作为前驱体，采用高温热解法制备出了一种新型的纳米类成分——射干炭纳米类成分（Belamcandae Rhizoma Carbonisatum nanocomponents，BRC-NCs），并利用透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）、紫外-可见分光光度法（ultraviolet-visible spectrophotometer，UV-vis）、傅里叶变换红外光谱（fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR）、荧光光谱和X-射线光电子能谱分析（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）对其进行了表征分析。此外，本研究利用CCl4所致急性肝损伤的动物实验来研究其对于肝脏的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 5周龄SPF级健康雄性昆明小鼠42只，体质量（30.0±2.0）g，动物质量合格证编号：No.110324201104285675，实验动物均购于斯贝福（北京）生物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0010。实验期间小鼠均饲养于同一环境下，保持室温（24.0±1.0）℃，空气湿度55%～65%，环境安静，小鼠自由进食进水，明、暗12 h循环饲养。本实验中小鼠均为脱颈处死，实验操作符合一般动物实验伦理学原则，经医学实验动物管理委员会批准。

1.2 药物与试剂 射干（批号：190628003），经北京中医药大学赵琰教授鉴定，为鸢尾科植物射干Belamcanda chinensis（L.）DC.的干燥根茎，采购于北京仟草中药饮片有限公司，生产日期为2019年6月28日；联苯双酯滴丸（规格：1.5 mg，批号：H11020980）购于北京协和药厂；生理盐水（批号：SD21022717）购于山东华鲁制药有限公司；四氯化碳（CCl4）溶液（批号：KYGG943）购于北京伊诺凯科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测定试剂盒（批号：20210407）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）测定试剂盒（批号：20210408）购于南京建成生物工程研究所；本实验用水均为去离子水。

1.3 主要仪器 PXR-9马弗炉（北京中科奥博科技有限公司）；PFT-100A高速万能粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；HH-1水浴锅（金坛市华城开元实验仪器厂）；Tecnai G220低分辨透射电子显微镜（美国FEI公司）；RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；JEN-1230高分辨透射电子显微镜（日本电子株式会社）；Escalab 250Xi X射线光电子能谱分析仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；F-4500荧光分光光度计（日本Hitachi公司）；CECIL紫外分光光度计（英国Cambridge公司）；傅里叶转换红外光谱仪（美国Thermo-Nicolet公司）；AU480全自动生化分析仪（美国贝克曼库尔特有限公司）；Leica RM 2016石蜡切片机（美国莱卡公司）。

1.4 BRC-NCs的制备 称取射干生药70 g放入坩埚中，用铝箔纸密封加盖后放入马弗炉中烧制。马弗炉的程序升温：第一阶段通过5 min升温至70 ℃，保留30 min；第二阶段通过25 min升温至400 ℃，保留1 h。待温度降至100 ℃以下取出坩埚，放置到室温。将烧制好的射干炭放入粉碎机中粉碎。称取炭粉50 g，用30倍去离子水煎煮3次，每次1 h。用滤纸粗滤，再用0.22 μm微孔滤膜精滤，合并3次滤液，浓缩，浓缩液用1 000 Da透析膜透析72 h，每4 h换水1次，取透析袋内溶液于4 ℃冰箱中留存，待用。

1.5 BRC-NCs的表征 用透射电子显微镜对BRC-NCs的微观结构进行分析。将制备好的BRC-NCs透析液倍比稀释后，用0.22 μm的微孔滤膜滤过，超声分散2 h，滴在铜网上，自然干燥。将铜网放于TEM显微镜下，选取合适的视野范围，观察其微观结构。将BRC-NCs透析液稀释至合适的浓度后，吸取2 mL于石英比色皿中，置紫外分光光度计内，在200～600 nm下对样品进行扫描。吸取上述样品2 mL于石英比色皿中，置荧光分光光度计内，以1 200 nm/min扫描。精密称取160 mg溴化钾粉末后放入玛瑙研钵中，加入BRC-NCs透析液20 μL，置红外灯箱中烘干、研匀，压片，放入傅里叶变换红外光谱仪中进行检测。

1.6 BRC-NCs元素分析 吸取50 mL BRC-NCs透析液滴于蒸发皿中，将蒸发皿放在水浴锅上烘干。待其完全干燥后用药匙轻轻刮取粉末，均匀铺在铝箔上，盖上一片铝箔，液压机压平后置X射线光电子能谱分析仪中进行测试。

1.7 荧光量子产率的计算 以硫酸奎宁[22]为参照物，通过以下公式计算BRC-NCs的荧光量子产率：

其中，“I”为发射光谱下的峰下面积，“A”为350 nm下的吸光度值，“η”为溶剂的折射率。“NCs”为BRC-NCs，“R”则代表标准品。荧光光谱扫描时，激发波长（λx）的狭缝宽度为10 nm，发射波长（λm）的狭缝宽度为5 nm。为了使重吸收效应最小化，其中AR和ANCs应在0.05以下。

1.8 药物的配制

1.8.1 BRC-NCs溶液的制备 取上述透析过后的适量BRCNCs溶液冻干后精密称取BRC-NCs粉末，加入适量去离子水配制成质量浓度为1 mg/mL的BRC-NCs备用。

1.8.2 阳性药的配制 取联苯双酯滴丸196粒，规格为1.5 mg/粒，加入19.6 mL的去离子水，配制成质量浓度为15 mg/mL的联苯双酯溶液。

1.8.3 造模药的配制 四氯化碳溶液与橄榄油溶液按1∶9的体积比例混合均匀，即得。

1.8.4 麻醉剂的配制[23]精密称量8.0 g水合氯醛粉末，倒入具塞三角瓶中，加入200 mL去离子水配制成4%的水合氯醛溶液，震荡完全溶解，备用。

1.9 动物分组及给药 42只SPF级健康雄性昆明小鼠随机分为6组，分别为正常组、模型组、BRC-NCs高剂量组（5mg/kg）、BRCNCs中剂量组（2.5 mg/kg）、BRC-NCs低剂量组（1.25 mg/kg）、联苯双酯组（150 mg/kg），每组7只。灌胃体积为0.1 mL/10 g[24]。BRCNCs的给药剂量按照成人用药剂量[25]换算成小鼠用药剂量（以BRC的质量计算）后，结合前期预实验筛选所得。实验方法如下[26]：BRC-NCs高、中、低剂量组和联苯双酯组小鼠灌胃相应药物，正常组和模型组灌胃给予等体积生理盐水，1次/d，连续给药7 d。末次给药2 h后，除正常组外，其余各组小鼠分别腹腔注射10%的CCL4橄榄油溶液制备急性肝损伤模型，正常组腹腔注射等体积的橄榄油。

1.10 观察指标

1.10.1 肝组织病理学观察 取肝右叶，用体积分数为4%的多聚甲醛溶液固定后，常规石蜡包埋、切片，HE染色，在光学显微镜下观察肝组织切片的病理学变化。

1.10.2 生化指标的测定 造模后的小鼠禁食不禁水，于16 h后摘眼球取血，常温静置4 h后置离心机中，3 000 r/min离心10 min，取血清，测定丙氨酸氨基转移酶（alanine transaminase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、直接胆红素（direct bilirubin，DBIL）、间接胆红素（indirect bilirubin，IBIL）的活性。将采血后的小鼠麻醉后脱颈椎处死，取肝组织0.5 g，用生理盐水漂洗后，用滤纸吸干水分，冰浴匀浆后离心，取上清液测定SOD、MDA的含量。

1.11 统计学方法 采用SPSS 25.0软件进行统计分析。计量资料以“均数±标准差”（）表示。多组间数据的比较当方差齐时，采用单因素方差分析，方差不齐时采用非参数检验。组间比较，采用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BRC-NCs表征结果 在低分辨透射电镜下观察发现，BRC-NCs为类球形且分散性良好，分布均匀。其粒径分布在1～7 nm之间，主要集中在4.0 nm左右。高分辨透射电镜观察结果显示，BRC-NCs晶格清晰，间距为0.263 nm。

2.2 光学特征和结构分析 BRC-NCs紫外光谱显示，在220 nm左右有微弱的紫外吸收峰，这可能是由于π-π*跃迁所引起的。荧光图谱显示，BRC-NCs的最大激发波长在350 nm左右，最大发射波长在446 nm左右。以硫酸奎宁为参照，计算其量子产率为1.62%。红外光谱结果显示，BRC-NCs的红外吸收峰分别为3 442.94 cm-1、1 635.93 cm-1、1 384.30 cm-1。分析可知，3 442.94 cm-1峰可能为-O-H键，1 635.93 cm-1的吸收峰可能为-C=O键，1 384.30 cm-1强吸收表示可能为-C-N键。红外光谱结果表明BRC-NCs表面含有羰基、羟基等官能基团。（见图1）

图1 BRC-NCs 的表征结果

2.3 元素组成和表面官能团分析 利用XPS法对BRC-NCs元素组成和表面官能团进行分析。结果显示，在284.32 eV、399.22 eV、531.22 eV有3个峰，表明BRC-NCs主要由C、O和少量N元素组成。样品中碳的含量为67.46%，氧的含量为28.59%，氮的含量为3.95%。在XPS高分辨率图谱中，C1s谱带显示有284.7 eV、286.3 eV、288.1 eV三个峰，分别对应于C-N[27]、C-O[28]、C=O[29]。O1s谱带显示有531.27 eV、532.66 eV两个峰，分别对应于C-O、C=O[23,30]。N1s谱带显示有399.5 eV、400.3 eV两个峰，分别对应于C-N、（C）3-N[31-32]。（见图2）

图2 BRC-NCs 的XPS 分析结果

2.4 各组小鼠肝组织病理学改变情况 HE染色结果显示，正常组小鼠肝组织结构正常，肝细胞无坏死、排列整齐，大小均匀，以中央静脉为中心呈放射状排列，细胞核位于细胞中央，圆整、边界清晰，肝小叶结构完整；模型组小鼠肝组织损伤严重，肝索排列紊乱，肝组织可见广泛弥漫性炎症细胞浸润，肝细胞排列紊乱，细胞结构被破坏，胞质空泡化等病变。与模型组比较，联苯双酯组小鼠肝组织结构大致恢复正常态，组织结构相对完整，肝小叶结构大致恢复正常态；BRC-NCs高、中、低剂量组小鼠肝组织损伤较轻，结构大致恢复正常，肝细胞排列较为整齐，炎症细胞浸润现象减轻，肝细胞坏死、变性情况明显降低，肝索逐渐恢复，肝损伤情况有所改善。（见图3）

图3 各组小鼠肝组织病理学改变情况（HE,×200）

2.5 各组小鼠血清ALT、AST、DBIL、IBIL含量比较 与正常组比较，模型组小鼠血清中ALT、AST、DBIL、IBIL含量均明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，联苯双酯组和BRC-NCs高、中、低剂量组小鼠血清中ALT、AST、DBIL、IBIL含量均明显降低（P＜0.05或P＜0.01）。结果表明，BRC-NCs对CCl4所致的急性肝损伤有明显的保护作用。（见图4）

图4 各组小鼠血清ALT、AST、DBIL、IBIL 含量比较（，n=7）

2.6 各组小鼠肝匀浆中SOD活力及MDA含量比较 与正常组比较，模型组小鼠肝组织匀浆中的SOD活性明显降低（P＜0.01），MDA含量明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，联苯双酯组和BRC-NCs高、中、低剂量组小鼠肝组织匀浆中SOD活性明显升高（P＜0.05或P＜0.01），MDA含量明显降低（P＜0.05或P＜0.01）。结果表明，BRC-NCs能够升高急性肝损伤模型小鼠肝脏组织中SOD的活性，降低MDA的含量。（见图5）

图5 各组小鼠肝匀浆SOD 活力及MDA 含量比较（，n=7）

3 讨论

多年来，研究者们往往从小分子化合物的角度去阐述中药炭药高温炭化后药效改变或增强的机制[33]，然而结果并不令人满意。随着纳米技术的深入研究，本团队将注意力转向纳米材料学，以此来阐述炭药炮制后物质基础的变化，并在前期研究中已经证实纳米类成分为炭药发挥药效的物质基础[34]。除传统认为的“炒炭止血”的经典活性之外，炭药还具有镇静[35]、降糖[36]、镇痛[29]、抗寒[37]等生物活性。进一步的研究显示，不同基源获取的炭药纳米类成分、相同基源不同炮制条件获取的炭药纳米类成分由于粒径、化学基团等性质的差异，生物活性呈现多样性的特点，如黄柏炭纳米类成分具有止血[38]、改善银屑病样炎症[39]的作用等。本实验以天然产物射干作为前驱体，从中制备并分离出了BRC-NCs，并通过TEM法分析显示，其粒径分布在1～7nm之间，晶格间距为0.263 nm。紫外、荧光结果显示BRC-NCs具有荧光现象，其荧光量子产率为1.62%。FT-IR、XPS等结果分析显示BRC-NCs主要含有由C、N、O三种元素组成且表面含有丰富的官能团如羰基、羟基。这种结构使其具有良好的溶解性和生物活性。

CCl4诱导的肝损伤是一种非常经典的肝损伤模型，广泛用于保肝药物筛选[40]。CCl4引起急性肝损伤的机制主要是CCl4可通过激活肝微粒体细胞色素P450产生CCl3和CCl3O2自由基。这些自由基可以与肝细胞中的大分子共价结合，攻击细胞质膜下的不饱和脂质，从而诱导脂质过氧化[41]。脂质过氧化及其降解产物会破坏肝细胞膜的完整性和稳定性，增加肝细胞膜的通透性，导致细胞质中ALT、AST等酶流入血液。因此，ALT、AST水平的高低是判定肝损伤程度的重要指标[42]。肝脏功能损伤反映为胆红素代谢缺陷，例如肝细胞摄取减少、胆红素结合受损和肝细胞胆红素分泌减少。肝脏系统的结构或功能异常可导致胆红素增加。因此，血清胆红素是检测肝脏代谢状态最直接的指标[43]。本实验中，模型组小鼠血清中ALT、AST、DBIL、IBIL活性明显升高。不同浓度的BRC-NCs干预后，血清中ALT、AST、DBIL、IBIL活性明显降低，表明BRC-NCs对CCL4诱导的急性肝损伤有保护作用。

自由基引发的促氧化剂和抗氧化剂之间的不平衡可导致氧化应激。有效抑制氧化应激可以控制肝损伤的进展[44]。MDA为脂质过氧化代谢的终产物，可损伤细胞，同时MDA不仅可以反映脂质过氧化的敏感性程度，还可以间接反映细胞损伤的程度[42]。SOD是细胞内主要的防御性抗氧化酶，可以清除自由基，减轻脂质过氧化的连锁反应，保护细胞膜的结构稳定性和功能完整性[3]。研究[45]表明，射干生药对DPPH、ABTS自由基有一定的清除能力，显示出一定的抗氧化活性。本实验结果表明，从射干炭中提取分离的BRC-NCs能有效缓解急性肝损伤小鼠肝组织中的炎症细胞浸润程度，降低肝细胞坏死、变性情况，其机制可能与降低MDA含量、升高SOD活性有关。BRC-NCs能够通过提高抗氧化能力来减轻过度氧化应激对肝组织的损伤作用。但本实验尚未从相关信号通路水平上去深入挖掘BRC-NCs的内在药效机制，这是课题组今后努力的方向之一。同时，后期研究也应开展BRC-NCs的安全性研究工作，探讨其在安全范围内发挥最大的药效剂量，以便更好地服务于临床，为指导临床合理用药提供科学依据。

综上，本研究利用高温热解法成功从射干炭中提取分离出新型纳米类成分——BRC-NCs。在CCl4致急性肝损伤模型中，表面携带丰富活性基团的BRC-NCs表现出较好的保肝作用，其作用机制与降低血清ALT、AST、DBIL、IBIL含量有关。此外，BRC-NCs也可以在一定程度上增强机体的抗氧化能力。本实验为BRC-NCs治疗急性肝损伤的新型药物研发奠定了实验基础和重要依据，也为中药炭药的物质基础研究提供了一种全新的思维模式及科研方法。