刘欣悦，张维娜，郭丽，汤心慧,2，赵天南,2，张裕民，张萍*

研究发现，包括卵巢癌在内的各种恶性肿瘤最主要的生物学特征是肿瘤细胞的失控性增殖，而细胞周期几乎涉及癌症进展的每个阶段，细胞周期的调控紊乱会导致细胞的失控性增殖[1]。着丝粒蛋白F(centromere proteinF,CENPF) 位于染色体1q41上，作为一种瞬时着丝粒蛋白，可调节多种细胞过程[2-3]。CENPF已在包括乳腺癌、肝细胞癌、甲状腺癌、前列腺癌、胃癌和胰腺癌等多种癌症中观察到上调[4-10]，CENPF参与肿瘤的进展和转移，与预后不良密切相关。此外，生物信息学分析表明，CENPF的表达与非肌层浸润性膀胱癌的进展和卵巢癌的预后相关[11-12]。然而，CENPF在卵巢癌中的具体作用尚不清楚。PI3K/AKT/mTOR信号通路是人类细胞分子调控机制的重要途径之一，在卵巢癌细胞增殖、侵袭、迁移和周期调控中均有重要的作用[13]，许多研究表明阻断PI3K/AKT/mTOR可作为治疗卵巢癌的有效靶点[14]。本实验通过生物信息学整合GEO(Gene Expression Omnibus)数据库中卵巢癌与正常卵巢样本同时合并细胞周期相关基因进行差异分析，发现CENPF作为核心基因在上皮性卵巢癌中显著高表达，并与生存密切相关。同时，通过体外实验探讨CENPF对卵巢癌细胞恶性行为的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养和化学试剂

人卵巢表面上皮细胞系(ovarian surface epithelial,OSE)由北京妇产医院中心实验室捐赠。人卵巢癌细胞株A2780、SKOV3、HEY、ES-2均保存于青岛市市立医院肝胆外科实验室。根据 ATCC 方案在指定培养基中培养所有细胞系，并补充10%(v/v)胎牛血清和1%青链霉素,在37°C的加湿培养箱中加入5% CO2。

1.2 细胞转染

为稳定敲低各种卵巢癌细胞系中的CENPF基因，本研究分别使用了Genechem公司提供的慢病毒GV493载体(沉默CENPF的两个不同片段，用于消除可能产生的脱靶效应，sh-CENPF#1∶5′-GCAACCATCTACTTGAAGA-3′;sh-CENPF#2∶5′-GCAGCGAGATTGTTCTCAA-3′)。实验方法遵循制造商的手册。感染后，用嘌呤霉素筛选细胞，获得稳定的转染细胞系。

1.3 CCK-8 测定

将转染的 SKOV3 和 HEY 细胞(5×103个细胞)种植到96孔板中。CCK-8试剂盒用DMEM稀释10倍。0、24、48、72 h分别用100 mL CCK-8溶液更换细胞培养基，在37°C培养箱中保持2 h，在450 nm处测量光密度(OD)，计算相对细胞活力。

1.4 细胞周期测定

将转染的SKOV3和HEY细胞(1×105个细胞)收集在1.5 mL管中用于细胞周期分析。加入1 mL预冷的75%乙醇后，将细胞在4°C下孵育过夜。第2天，按照制造商的方案使用细胞周期和凋亡分析试剂盒对细胞进行染色。通过流式细胞术检测染色的细胞。ModFit LT软件用于测量结果。

1.5 Transwell实验

Matrigel基质胶提前取出放置4°C冰箱中，融化状态备用。在Transwell小室的上室面底部加入Matrigel基质胶。置于培养箱1 h，当出现白色层时取出待用。将SKOV3和HEY细胞重新悬浮在无血清培养基中，并将10% FBS添加到下室并在细胞培养箱中培养48 h，预冷的PBS冲洗2遍，用棉签擦拭净基质胶及上室面细胞，随后，将下室中的细胞固定在4%多聚甲醛中，随后用0.5%结晶紫染色15 min。镜下计数穿过膜的细胞数。随机选择3个不同视野计数。

1.6 细胞划痕实验

将转染的SKOV3和HEY细胞接种在含有常规生长培养基的6孔板中，并使其生长至汇合。使用移液管尖端在汇合的单层细胞中产生单个划痕并用PBS冲洗。划痕后加药(激动剂或抑制剂)，使用荧光显微镜在0 h、24 h的相同位置(划痕区域)获取图像。拍照结束后用Image J软件测量细胞迁移的距离，以愈合率=(0 h划痕面积-当前划痕面积)/0 h划痕面积×100%进行数据统计。

1.7 蛋白质印迹分析

提取细胞蛋白，BCA法检测蛋白浓度，取1/4体积5×上样缓冲液与其混合均匀，100℃变性5 min；取等量蛋白(40 μg)上样，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后，转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。质量分数为5%脱脂奶粉封闭含目的条带区域的PVDF膜2 h,TBST洗膜10 min×3次；加入一抗CENPF、PI3K、AKT、p-AKT、m-TOR和GAPDH抗体，4℃孵育过夜，PBS洗膜后加入HRP标记的羊抗鼠兔通用IgG室温孵育1 h，PBS洗膜后用ECL化学发光进行显色。以GAPDH为内参蛋白，采用Image J图像分析软件进行灰度分析，计算蛋白相对表达量。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 确定与卵巢癌细胞细胞周期相关的关键调控因子

GSE14001、GSE54388、GSE40595和GSE14407是从GEO DataSets(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)下载的mRNA微阵列。使用R包“affy”和“sva”对数据进行去批次处理和标准化，总共合并了80个卵巢癌样本和27个正常卵巢样本。从MSigDB中提取和收集了一组细胞周期相关基因。“limma”R软件包对组合数据进行差异分析，截止标准为FDR<0.05和|log2fold change(FC)|>1，获得了149个细胞周期相关的差异基因。使用string(http://www.string-db.org/)和cytoscape的MCODE构建PPI网络，筛选hub基因，得到17个hub基因(图1A)。R语言绘制火山图，如图1B所示，左侧代表下调基因，右侧代表上调基因，可以看到CENPF作为一个细胞周期相关基因在卵巢癌组织中显著上调。使用TCGA数据库将人卵巢癌组织中CENPF的相对mRNA水平与正常组织进行比较。根据426个肿瘤组织和88个正常组织的比较，在卵巢癌组织中观察到高水平的CENPFmRNA(图1C)。此外，对数据库(http://kmplot.com/analysis/)的生存分析显示，CENPF的mRNA水平与卵巢癌患者的总生存率和无进展生存率相关(图1D)，表明CENPF表达与患者预后密切相关。随后，检测其在卵巢癌细胞系(SKOV3、A2780、HEY和ES-2)中的表达，并以OSE作为对照。蛋白质印迹分析结果显示，卵巢癌细胞系中CENPF的蛋白表达均明显高于OSE细胞系(图1E)。其中SKOV3和HEY中CENPF的相对蛋白表达量较高，用于后续实验研究。

注：A.卵巢癌细胞周期相关的核心基因。B，C.CENPF在卵巢癌组织中表达情况。D.CENPF表达与生存预后的关系。E.CENPF在正常卵巢上皮细胞与卵巢癌细胞系中的表达情况。与正常卵巢上皮细胞相比，**P<0.01。

2.2 沉默CENPF可以抑制卵巢癌的恶性行为

蛋白质印迹分析表明沉默CENPF表达的卵巢癌细胞系(SKOV3和HEY)验证成功(图2A，见彩插4)。相比空转对照(sh-NC)组，CCK-8细胞活力测定证明，沉默CENPF组(含sh-CENPF#1组和sh-CENPF#2组)的细胞增殖明显被抑制(P<0.01)(图2B,见彩插4)，划痕实验验证沉默CENPF组的迁移能力也较对照组显著下降(P<0.01)(图2C，见彩插4)，transwell实验证实沉默CENPF组的侵袭能力较对照组也明显减弱(P<0.01)(图2D，见彩插4)，流式细胞术显示细胞沉默CENPF组的周期细胞停滞在 G2/M 期(图2E,见彩插4)。

2.3 CENPF可能通过PI3K/AKT/mTOR通路促进卵巢癌细胞的恶性行为

在沉默CENPF的卵巢癌细胞系中对PI3K/AKT/mTOR信号通路中的基因进行蛋白质印迹分析，结果表明与空转对照(sh-NC)组比较，PI3K的表达有所下降，在AKT本底不变的情况下，AKT的磷酸化明显被抑制，在mTOR本底不变的情况下，mTOR的磷酸化也明显被抑制，差异均有统计学意义(P<0.05)，详见图3。

注：与sh-NC组相比，*P<0.05，**P<0.01。

3 讨论

细胞周期在肿瘤的发生和发展中起重要作用，异常的细胞周期调节导致细胞增殖失控。肿瘤细胞周期紊乱通常是由癌基因的变化引起的，这使其成为癌症治疗的一个有吸引力的途径[15-16]。作为细胞周期相关的调节因子，CENPF已被报道为许多肿瘤中的致癌基因。然而，CENPF 在卵巢癌进展中的确切作用仍然知之甚少。CENPF基因编码与着丝粒-动粒复合物结合的蛋白质，该蛋白质是细胞间期G2期核基质的组分，其在细胞周期中逐渐累积，直至在G2和M期细胞中达到峰值水平，并且在有丝分裂完成后迅速降解。CENPF首先于G2晚期在动粒前复合体中被检测到，在有丝分裂期间，CENPF 与来自前中期的动粒相关，这种关联一直维持到后期，在整个后期的剩余部分中在纺锤体中区可以被检测到[17]。

本研究通过 GEO 数据库和细胞周期相关基因，分析了卵巢癌和正常卵巢组织样本的差异，发现CENPF作为细胞周期的核心基因在卵巢癌中高表达，并且CENPF的表达水平与卵巢癌患者的总生存率和无进展生存率缩短显著相关。以往的研究表明，CENPF 表达异常并改变了各种类型肿瘤的进展，如CENPF过表达与乳腺癌预后不良和骨转移有关[18]，FOXM1-CENPF轴参与前列腺癌的转移[8]，CENPF蛋白是鼻咽癌进展的有价值标志物，CENPF表达与患者总生存期密切相关[19]，本研究结果与其一致。CENPF的缺失表达可以破坏动粒功能，使染色体分离滞后，从而延迟有丝分裂进程，其高表达还与染色体不稳定性(chromosome instability,CIN)标志物密切相关，包括细胞周期蛋白E过度表达、端粒酶活性增加、核生存素的高表达、c-Myc扩增等[20]，这些CIN标志物的异常表达发生在大约20%的高级别浆液性卵巢癌中，并且与不良预后相关[21]。有研究证明，敲低CENPF抑制了骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭[22]，沉默CENPF可以使肝癌细胞在细胞周期G2/M期停滞并抑制Cyclin B1和Cyclin E1表达，还可以抑制ERK的磷酸化和NEK2的表达[23]。本研究证实了沉默CENPF可以抑制卵巢癌细胞的增殖、侵袭、迁移以及导致细胞有丝分裂G2/M期的停滞，说明靶向敲除CENPF可能抑制卵巢癌的恶性行为。

研究表明，CENPF的过表达与乳腺癌的预后不良和肿瘤骨转移相关，且激活PI3K/AKT/mTORC1信号传导促进乳腺癌的骨转移[24]。本研究检测了PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白的表达，结果提示沉默CENPF明显降低了PI3K、p-AKT/ AKT、p-mTOR/ mTOR的表达量。PI3K/AKT/mTOR信号通路在维持正常细胞功能中起着重要作用，PI3K、Akt和mTOR是该通路的三个主要节点，对其靶向调控在包括卵巢癌在内的许多人类癌症的发病机制中发挥着关键作用[14]，尤其是pSer在473位点激活AKT可以有效调控肿瘤细胞的恶性行为[25]，激活后的磷酸化AKT可以进一步磷酸化mTORC1直接激活mTOR[26]。大量研究证实，PI3K/AKT/mTOR调控细胞增殖、分化、细胞代谢和癌细胞存活，PI3K/AKT/mTOR的激活促进了肿瘤的发展，形成耐药性[27-28]。本研究结果表明CENPF可能是PI3K/AKT/mTOR通路的一个上游靶标，控制卵巢癌的增殖、侵袭、迁移及有丝分裂。

本研究通过整合卵巢癌中细胞周期核心基因，筛选出在卵巢癌中高表达且与生存预后密切相关的基因，分别从细胞功能及分子机制方面对CENPF促进卵巢癌的恶性行为进行研究，为靶向治疗卵巢癌提供了新的方向。但本研究仍不全面，还需加入相关通路激动剂、抑制剂来观察细胞功能改变，进一步完善其分子机制，通过体内研究更深入了解CENPF在卵巢癌中的作用。