侯明霞，叶飞，熊东升，刘伟信，曾玖芝，孙燕

母体子宫对于胚胎来说是一个恒温恒湿的稳定生理环境[1]。温度作为培养过程中的关键因素，过高、过低都会影响卵子和胚胎的发育，其中影响最显著的是纺锤体稳定性和胚胎代谢水平[2]。就目前的取卵方式而言，卵泡液在回收过程中流经回收管时温度不可避免会下降，因此在收取卵泡液时，维持卵泡液温度在37℃，对胚胎后续发育至关重要。本研究自行设计一套卵泡回收加热系统，以确保在获取卵子过程中卵泡液温度始终维持在37℃，探讨在取卵过程中控制卵泡液的温度变化对体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)临床结局的影响，现报道如下。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

选择2020年6月至2021年10月在四川省妇幼保健院因输卵管阻塞行IVF-ET治疗的146例患者，将其按来院就诊次序随机分为对照组和研究组，每组73例(利用PASS15软件计算得到对照组和研究组样本数为n1=n2=58例，考虑到患者退出情况则需样本量n1=n2=58/0.8≈73例)。

纳入标准：① 患者年龄<35岁，体质量指数(body mass index，BMI)18～25 kg/m2；② 月经周期规律(22～35 d)；③ 既往无卵巢手术史、B 超检查双侧卵巢外观正常,无输卵管积水及多囊卵巢综合征病史；④ 无影响卵巢功能的内分泌疾病；⑤ 丈夫精液检查正常。

1.2 试剂耗材

试剂均购买于COOK公司，耗材购买于美国BD FALCON公司。卵泡液回收加热系统由本实验室设计，广州品知医疗器械有限公司按照实验设计生产出成品(见图1)。

注：1.保温套；2.卡槽；3.魔术贴(31.魔术贴勾面；32.魔术贴毛面)；4.套环；5.加热头；6.电线；7.加热器连接头

1.3 研究方法

对照组按照常规取卵步骤操作。研究组在常规取卵基础上增加卵泡回收加热系统进行操作：将卵泡回收加热系统安装在卵泡回收系统输送软管上，温度设定在38.6℃，然后模拟取卵过程将37℃生理盐水作为卵泡液通过卵泡液回收加热系统抽吸到14 mL圆底试管，此时测定圆底试管中生理盐水温度为37℃，因此卵泡回收加热系统在使用时温度应设置为38.6℃。

根据患者基础内分泌水平、卵巢储备等情况按照常规促排卵方案，当1～2枚卵泡直径≥18 mm时注射重组人绒毛膜促性腺激素 (recombinant human chorio gonadotropin，rhCG，艾泽，德国默克雪兰诺)，36．5～37.0 h 阴道B超引导下取卵，所获卵母细胞短时受精 4 h后去除颗粒细胞观察受精情况。将受精卵培养皿置于时差监控培养箱(6.0% CO2，5% O2，37.0℃)培养，D3均选择来源于2PN胚胎 1～2枚进行移植，剩余可利用胚胎换液后继续进行培养至D6，记录囊胚形成情况。

1.4 观察指标

观察记录正常受精率、多PN受精率、卵裂率、D3优质胚胎率、囊胚形成率、优质囊胚率、临床结局以及胚胎动力学参数。胚胎动力学利用时差监控系统记录胚胎从原核发育至不同细胞期所需时间，其指标如下：发育至 2 细胞的时间为 t2，发育至4细胞的时间为 t4，发育至5细胞的时间为 t5,发育至8细胞的时间为 t8。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 两组患者一般资料比较

两组患者年龄、不孕年限、BMI、总Gn量、总Gn天数和移植胚胎数比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，详见下页表1。

表1 两组患者一般资料比较

2.2 两组患者胚胎质量及妊娠结局比较

研究组D3优质胚胎率和临床妊娠率高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；两组正常受精率、多PN受精率、卵裂率、囊胚形成率以及优质囊胚率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。但研究组卵裂率、囊胚形成率有升高趋势，并且多PN受精率有所下降，详见下页表2。

表2 两组患者胚胎质量及妊娠结局比较

2.3 两组患者胚胎发育速率比较

两组患者胚胎发育速率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，详见下页表3。

表3 两组患者胚胎发育速率比较

3 讨论

胚胎体外培养涉及多个环节，从卵泡液离开卵泡开始，各种外部环境开始影响卵子和胚胎质量，而胚胎质量将直接影响移植后的临床结局。除去配子和胚胎本身质量外，影响它们的外部因素有很多，从实验室角度，主要有操作因素、环境因素等，其中环境因素最为复杂，比如环境温度、湿度等。由于监控的节点较多，目前胚胎实验室广泛关注的是胚胎培养过程中的环境控制，尤其是培养过程中温度的监控，而常常忽略卵泡液获取过程中温度的控制和监测。本中心以37℃生理盐水模拟卵泡液，然后模拟卵泡液获取整个流程发现，37℃的生理盐水经过常规卵泡回收系统流入14 mL圆底试管后，温度会降至34℃～34.5℃。因此，本研究关注于该过程中温度的控制，自行设计和组装一套简易的卵泡回收加热系统用于卵泡液回收过程中温度的控制，探究卵泡液回收过程中温度对胚胎质量以及临床结局的影响。

温度对胚胎发育有至关重要的影响，人体的基础体温是37℃，常规理论认为，37℃是配子体外受精和发育的最适温度(输卵管温度和宫腔温度)[3-4]。然而，有研究发现，人卵泡液内温度低于37℃，大约低2.3℃，因此，理论上认为36℃更接近生殖道温度，也许更有利于胚胎发育[5]。不过，Hong KH等[6]一项前瞻性随机对照研究认为，在控制培养箱温度波动、类型及pH值等因素后，37℃培养的胚胎与36℃相比，第3天细胞数更多，囊胚形成率更高，而着床率和非正整倍体率差异无统计学意义。而低温对配子和胚胎的影响是明确的，在小鼠卵母细胞中，从37℃分别冷却至25℃、18℃或4℃会导致减数分裂纺锤体的微管破裂；当温度恢复到37℃时，这种破坏就会逆转[7]。相比之下，人类卵母细胞冷却至室温会导致纺锤体的破坏且不可逆转[8]。Sherbahn R[9]的研究结果显示，取卵时卵泡液温度超过36.4℃～36.9℃这一范围，将影响胚胎囊胚形成率、着床率及活产率，提示配子及胚胎在体外离开培养箱后，温度降至36.4℃下，可能对胚胎后期发育产生影响。

目前尚不清楚温度变化是否会影响胚胎植入或活产。现有的研究表明，体外培养条件(包括温度)可能会影响胚胎植入前的有丝分裂非整倍性或嵌合比例[10-11]。Walters EA等[12]认为现有的研究并不支持胚胎培养过程中调节温度，在37.0℃的稳定温度下进行培养可能更稳妥。

本研究利用卵泡回收加热系统对卵泡液从卵泡到取卵管这个过程温度的控制，发现D3优质胚胎率(62.36%)和临床妊娠率(57.78%)较对照组(43.87%，46.51%)有明显提高，囊胚形成率、卵裂率有升高的趋势。但胚胎动力学观察未发现两组间差异有统计学意义。有研究表明36℃培养和37℃培养胚胎，移植后妊娠率差异无统计学意义，但过低温度卵裂率和妊娠率显著下降[13-17]。

综上所述，虽然最适宜的胚胎培养温度还有争议，但目前大家公认的配子和胚胎维持温度是37℃，所以应当在每一个环节对温度做好控制和监测。本研究在取卵过程中实施的保温措施仅是初步探索，还需要增加样本量进一步验证该项保温措施对胚胎质量和妊娠结局的影响。