闫 炎，孟凡茹，魏语泽，张 昊，赵 伟，裴志花，王 开，胡桂学

（吉林农业大学动物医学院，吉林长春 130118）

紧密连接是肠上皮细胞间的主要连接方式，不仅能阻碍外界病原体入侵，还能选择性地调节小分子物质和离子进入体内，对维持上皮细胞的正常生理功能发挥重要作用。紧密连接结构主要是以Claudin家族为核心，通过与Occludin家族、ZO家族、膜脂等之间的机械力动态地驱动紧密连接的组装，保证紧密连接结构的稳定。肠道的紧密连接结构一旦被破坏，就会引起肠腔内有害物质及外来病原体的渗透，进而引起炎症反应及黏膜系统的紊乱，引发多种肠道疾病。目前已有动物试验证明，在由病原体引起的肠细胞感染中，能够检测到相关紧密连接蛋白结构及表达的变化，进而破坏肠道黏膜完整性。本文综述了肠道紧密连接蛋白结构、功能及调控通路的研究进展，归纳了由紧密连接改变引起的各种肠道疾病，为紧密连接的后续研究和寻找肠道疾病的治疗方案提供一定的理论基础。

1 紧密连接的结构

紧密连接为多种蛋白相互作用下形成的复合结构，位于上皮顶端两细胞间，其结构可以通过电子显微镜观察到。在超薄切片上观察，紧密连接表现为相邻质膜紧密贴合的区域，其中相邻质膜能够部分融合。而在冷冻复型电镜下，它们表现为纤维网络状（即紧密连接链）每条紧密连接链与相邻细胞相对膜中的另一条紧密连接链横向结合，形成“成对的”紧密连接链。紧密连接是一种高度动态的结构，通过对紧密连接蛋白的定位和表达，来适应不断变化的环境条件，对维持细胞屏障的完整性有重要意义。其中，Occludin家族、Claudin家族以及ZO家族是构成细胞间紧密连接的重要蛋白分子。

2 紧密连接的组成

2.1 Occludin家族 Occludin是最早被鉴定出的紧密连接跨膜蛋白，属于含Marvel结构域蛋白质家族，大小为65 ku，包含4个跨膜结构域，1个细胞内小环，2个细胞外环，以及细胞内定位的C和N末端。Occludin的N端有助于维持紧密连接的完整性，而C端结构域富含潜在的磷酸化位点，能与激酶和磷酸酶相互作用。此外，Marvel基序、C端和ZO蛋白家族共同决定了Occludin是形成顺式二聚体结构还是低聚结构。其中，Occludin与ZO蛋白家族的相互作用还决定了Occludin在紧密连接中的迁移和定位，影响了肠道的屏障功能。

2.2 Claudin家族 1988年，Claudin被Furuse等首次发现，并证明了过表达的可以在成纤维细胞中重建紧密连接。随后，通过基因敲除去除或用Claudin结合的产气荚膜梭菌肠毒素片段处理可以减少紧密连接的形成，进一步证明了Claudin是构成紧密连接的一部分。随着对Claudin的研究逐渐深入，发现小肠上皮细胞中存在多个Claudin亚型。目前，已经确认了Claudin蛋白家族的27名成员，其大小在20～27 ku，由4个跨膜区、2个胞外环和1个细胞质羧基尾巴组成。Claudin蛋白家族在细胞间的两亲性使其产生屏障或空隙，从而能够选择性地渗透离子，是跨膜运输的主要决定因素。

2.3 ZO家族 除跨膜蛋白外，紧密连接还由胞质蛋白ZO家族组成，这是一种重要的接头蛋白，它将Claudin、Occludin和Tricellulin等跨膜蛋白与细胞骨架连接起来，从而使蛋白质复合物能够聚集到紧密连接的细胞内结构域。目前已发现3种ZO蛋白的异构体（ZO-1、2、3），它们大小在220 ku左右，都具有3个PDZ结构域、1个SH3结构域和1个GUK结构域。除了紧密连接，ZO蛋白还在基于Cadherin家族的黏附连接中被发现，影响着细胞的增殖、迁移和凋亡。ZO-1和ZO-2还能与Claudin直接结合并定位。Phua等研究证明，ZO-1、ZO-2缺失的细胞不能形成紧密连接。ZO-1是ZO蛋白家族中最早被发现的胞质蛋白，除了能够协调紧密连接的形成，它还能与共同参与上皮细胞顶基极性的建立和维持。有研究显示，敲除小鼠基因会导致aPKC和ZO-1的错误定位，从而破坏紧密连接复合体的稳定性。

3 紧密连接的功能

3.1 维持肠屏障功能完整 紧密连接蛋白定位和表达的异常是肠屏障通透性改变的重要标志，肠屏障通透性改变则会引发一系列肠道疾病，如胃肠炎。其中，病毒感染是胃肠炎最常见的原因，超过60%的腹泻症状都与病毒感染有关。当仔猪感染猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）时，小肠上皮细胞的紧密连接结构被破坏。Zong等通过观察PEDV感染仔猪的紧密连接蛋白的表达情况，发现和在维持肠上皮细胞的完整性和抵御PEDV感染方面发挥着重要作用。Luo等的研究还证明了Occludin参与了PEDV的入侵。此外，有研究利用淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（Lymphocytic Choriomeningitis Virus，LCMV）感染小鼠，这种病毒可以在肠内造血细胞和间充质细胞中长期复制，通过用FITC标记4-kD葡聚糖后，发现肠道通透性明显增加，并且病毒感染引起了编码Claudin-23和PALS相关的紧密连接蛋白的基因显著下调。此外，I型IFN信号增强LCMV感染小鼠肠上皮细胞通透性和免疫细胞的募集，下调紧密连接相关基因的表达，促进肠道菌群移位，并增强了CD8 T细胞的应答。Ding等发现，通过其细胞外环ECL2和猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒的表面蛋白GP3之间能相互作用来中和病毒，阻碍病毒的吸收和感染，为研究新的抗病毒策略提供了参考。

除病毒感染外，细菌感染也是引起肠道屏障损伤的重要影响因素之一。如革兰氏阴性菌产生的促炎性脂多糖被认为是肠漏时炎症发生的关键因素。在正常情况下，肠上皮可以防止促炎性脂多糖移位，但在饮食诱导肥胖（DIO）小鼠模型中，循环中的脂多糖水平较高，周围组织中的炎症程度较低。这表明肠道微生物区系中促炎性脂多糖水平的升高可能反过来通过增加跨上皮渗透性而加剧低度炎症的状态，从而促进更多的促炎性脂多糖转移到循环中。此外，与正常组小鼠对比，DIO小鼠肠黏膜中ZO-1的分布发生改变并伴随着的表达量减少，导致跨上皮通透性增加。Karve等还评价了stx1和stx2a对肠道屏障功能的影响，发现肠道在暴露于这两种毒素后，无论是在管腔内还是在基底侧隔室，均观察到跨上皮通透性随感染剂量和时间的增加而显著增加。此外，还伴随和等几个关键紧密连接蛋白和结构蛋白的基因表达量异常上调。然而，一些细菌却对维护肠屏障完整具有积极作用，如是主要的丁酸盐产生菌之一，其产生的丁酸盐是肠上皮细胞的关键能量来源，可以通过促进黏蛋白合成、紧密连接重组以及和的上调来减轻局部炎症和改善肠道屏障通透性，对II型糖尿病的治疗具有积极作用。

肠屏障完整对维护肠道健康具有重要意义。目前已经发现，紧密连接蛋白定位或表达的改变已成为诊断一些癌症和炎症性疾病的重要标志。特别是Claudin家族成员，如在克罗恩病、溃疡性结肠炎和乳糜泻中均能检测到的表达增加，通过促进阳离子和水通过细胞旁途径流入肠腔，从而引起腹泻。Ishida等在高分化直肠神经内分泌肿瘤样本中发现表达的增加，这证明的表达依赖于内分泌肿瘤的起源部位。虽然Claudins的磷酸化是维持其功能所必需的，但异常的磷酸化会影响其定位和结构的稳定性，从而导致上皮屏障功能受损。在一项对直肠癌患者的研究中，过表达促进了肿瘤的形成。

3.2 维持上皮极性 细胞极性是指细胞表现出形态和分子的不对称性，细胞的极性使其能够对邻近细胞和内环境的变化做出反应，在调节细胞迁移、增殖、分化等生理过程中起关键作用。在肠道中，肠上皮细胞有与内环境接触的顶膜，密封细胞旁间隙的侧膜，以及锚定在细胞外基质上的基底膜，故肠上皮细胞具有顶基底端极性（Apico-Basal Polarity，ABP）。其 中PAR（Par3/Par6/aPKC）和Crumbs（Crb/Pals1/PATJ）复合物在紧密连接的组装过程中起关键作用。Bruurs等用W4细胞（一种肠道细胞极化的单细胞模型）验证出需要通过小GTP酶Cdc42和其鸟嘌呤核苷酸交换因子Tuba的信号将顶膜限制在单个区域内，使ABP发挥正常功能；而Par6A、Cdc42和GFTuba共定位在顶膜形成三聚体复合物，是肠细胞极化过程中形成单一顶端结构域所必需的。此外，极性蛋白复合物还能与控制细胞间连接的紧密连接和黏附连接共同作用。如在果蝇上皮细胞ABP的建立中，或任意基因的缺失都能引起细胞极性的破坏，从而使相关紧密连接蛋白分布异常，影响紧密连接的正常功能。Otani等也在MDCK II细胞中证明敲除和会使细胞极性丧失，并且其通过与Claudin和JAM-A共同调节紧密连接的结构和功能。上皮细胞极性的建立对于屏障的形成和营养物质的摄取及载体运输至关重要，一些癌症的发生（如结肠癌、乳腺癌和肝癌等）正是以上皮细胞极性丧失为重要标志。

4 紧密连接的调控通路

到目前为止，研究已经证明了许多信号通路参与了紧密连接功能的调节，如蛋白激酶C（PKC）、蛋白激酶A（PKA）、Rho/ROCK、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/AKt通路等。近年来，有关紧密连接调控的研究主要集中在Rho/ROCK信号通路及MAPK信号通路上。

4.1 Rho/ROCK信号通路 Rho是Ras超家族的成员，属于小分子GTP结合蛋白，通过在GTP结合的活性构象和非活性构象之间的切换发挥GTP酶的作用，并被证明能够广泛调节肠上皮细胞功能。与其他GTP酶一样，其与GDP的结合状态主要受到GEF、GAP和GDI 3种类型分子的调控。它们在肠上皮细胞中高度表达，并能够被细胞外的细菌、炎症因子、生长因子等激活。RhoA是一种特性较好的RhoGTP酶，在静息和炎症条件下具有降低屏障渗透功能的作用。RhoA的下游效应分子是Rho相关的螺旋线圈状激酶ROCK，ROCK属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的成员。它通过直接磷酸化MLC2或MYPT1引起pMLC的积累来诱导肌球蛋白收缩和紧密连接和黏附连接的解体。

在一些由促炎因子引起的肠道炎症（如TNF-、IFN-、IL-1等）中能通过促进上皮紧密连接蛋白内吞从而损害屏障功能，这一过程是由Rho-/ROCK-/MYPT-/MLC介导的肌动球蛋白环周收缩控制的。此外，在克罗恩病患者和TBNS诱导结肠炎的大鼠的发炎结肠黏膜中均能检测到RhoA/ROCK活化增加。而一些细菌（如肠沙门氏菌和幽门螺杆菌）通过向上皮细胞注入自身蛋白来激活RhoA/ROCK信号，进而损害紧密连接的结构和功能。此外，内毒素（一种由革兰氏阴性细菌外膜形成的毒素）通过增加p115RhoGEF蛋白水平来激活RhoA，这也具有破坏上皮屏障的效果。

4.2 MAPK信号通路 MAPKs是一类高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，能够响应多种细胞微刺激，特别是在炎症信号转导过程中起到激活转录因子和多种核蛋白、调控基因表达、细胞分化和凋亡的作用。MAPK信号通路通过一系列的磷酸化步骤被激活，首先是MAPK激酶的激活，其次是MAPK激酶磷酸化并激活MAPKs，主要包括丝裂原活化蛋白（p38）、细胞外调节蛋白激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）等，它们共同参与细胞紧密连接屏障功能的调控。在人肺微血管内皮细胞中，普通肝素通过抑制ERK1/2来降低内皮屏障的高通透性并下调和的表达，从而保护紧密连接免受脂多糖诱导的损伤。在人真皮微血管内皮细胞中，内源性Src家族激酶的激活通过激活p38使内皮屏障对低剂量的TNF-更敏感，从而导致内皮细胞紧密连接的损伤。此外，髓过氧化物酶衍生的氧化剂能通过ERK1/2和JNK级联途径诱导血脑屏障功能障碍。

近年来，一些研究也证实了病原体刺激可以通过MAPK信号通路影响肠道紧密连接的变化。Wang等发现，猪圆环病毒II型感染猪气管上皮细胞降低了和的表达水平，且激活了JNK/MAPK信号通路，影响了肠道的屏障功能。Zhao等比较了PEDV和传染性胃肠炎病毒（Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV）对紧密连接的损害作用，发现PEDV和TGEV感染都可以通过影响MAPK通路来下调部分紧密连接和黏附连接蛋白的表达，在感染早期即可损害IPEC-J2细胞的屏障完整性。Wang等发现，IL-17A和IL-17F通过上调紧密连接相关基因（包括）的表达，修复了HIV-1gp40导致的肠上皮屏障功能障碍，还发现NF-κB和MAPK通路参与了IL-17A和IL-17F介导的肠上皮屏障完整性修复。

5 展 望

紧密连接作为肠上皮细胞屏障的重要组成部分，对维持肠道的正常生理功能至关重要。紧密连接蛋白是许多致病细菌和病毒的靶标，它们通过劫持紧密连接蛋白的循环过程（内化、水解、合成和释放）进入细胞并感染细胞，或者通过信号通路机制使细胞间产生间隙。对肠道紧密连接进行更加深入地研究有助于更好地了解肠道疾病的作用机制，从而有效地防控肠道疾病。另外，紧密连接不仅存在于肠道中，还能在内皮细胞中起到维护血管稳态、血脑屏障完整的作用。自首个紧密连接蛋白Occludin被发现以来的几十年间，有关于紧密连接的结构和功能的研究迅速发展，但对于紧密连接的研究仍处于初步阶段，对于紧密连接与肌动蛋白细胞骨架、机械力、极性信号和膜脂协同调控上皮屏障功能和细胞极性的研究仍不成系统。随着对紧密连接的研究不断深入，将能够构建出完整的紧密连接结构模型，更细致地了解紧密连接的作用机制，并为紧密连接引起的肠道疾病提供更好地防治方案。