苏晓梅 朱春宇，2 刘淑梅 王施慧 吕宏君 侯丽霞*

〔1 山东省农业科学院蔬菜研究所，山东省设施蔬菜生物学重点实验室，国家蔬菜改良中心山东分中心，农业农村部黄淮地区蔬菜科学观测实验站（山东），山东济南 250100；2 中国农业大学园艺学院，北京100193〕

番茄颈腐根腐病（Fusarium crown and root rot，FCRR）是由尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型（f.sp.-，Forl）侵染引起的土传性真菌病害，在设施生产中多有发生并逐年严重。近年来，随着番茄设施栽培面积增大及种植年限增加，颈腐根腐病已成为影响番茄收益的重要病害之一。然而我国有关番茄颈腐根腐病的研究报道较少，且多数集中在病原菌鉴定以及防治措施的简单描述方面，在颈腐根腐病抗性鉴定及抗源筛选方面的工作相对落后，抗病育种工作进展也较为缓慢。本文综述了该病害的国内外最新研究进展，以期为我国番茄颈腐根腐病的抗病育种提供借鉴。

1 番茄颈腐根腐病的发生情况

番茄颈腐根腐病俗称“死棵病”，是近年来温室内发生比较严重的一种真菌性病害。该病害最初于1974 年首次在日本被发现（Sato &Araki，1974），之后蔓延到世界各地，已对美国、日本、加拿大、墨西哥、以色列、韩国以及欧洲和非洲等许多国家和地区的番茄生产造成重大损失（Sonoda，1976；Krikun et al.，1982；Brammall，1990；Mcgovern et al.，1998；Kim et al.，2001；Can et al.，2004；Portapuglia et al.，2005；Hibar et al.，2007；Jacobs &Heerden，2012；Sepúlveda-Chavera et al.，2014）。我国于2007 年首次在北京地区发现该病害（耿丽华 等，2012），随后山东、黑龙江等地设施番茄主产区发生该病害，并呈现暴发趋势。目前在山东、辽宁、宁夏、北京、黑龙江、河北、山西、甘肃等很多地区均有番茄颈腐根腐病发生的报道，严重威胁我国设施番茄生产（程琳 等，2016；张尚卿 等，2017；李潇 等，2019）。最近几年，我国东北、华北地区发病比较严重，尤以山东省寿光地区病情最为突出。据报道，寿光日光温室番茄发病率达80%以上，致死率30%以上，造成番茄严重减产（程琳 等，2016）。

2 番茄颈腐根腐病的发病症状及规律

番茄颈腐根腐病常发生于保护地冬春季番茄生产中，在幼苗期和成株期均可发生，幼苗期（3～5片叶）染病时主要症状表现为在土壤与植株茎基部接触部位出现明显的深褐色病斑，幼苗从病斑处折倒而萎蔫致死；5 叶期以后至开花结果期发病则出现茎基部缢缩且呈深褐色，植株直立而萎蔫的症状（Menzies et al.，1990；耿丽华 等，2012），萎蔫最早出现在一天温度最高时，夜间恢复。把染病的植株纵向剖面后，可以在根和根茎的皮层看到大量的褐变斑点和腐烂现象。由于对该病害了解较少，其经常被误认为番茄枯萎病。研究表明，番茄颈腐根腐病与枯萎病在3 个方面有明显差异：①发病症状不同。颈腐根腐病病原菌主要造成番茄茎基部和根部褐变腐烂，茎部维管束褐变通常在土壤线上方25～30 cm 以内，而枯萎病病原菌（f.sp.）为害维管束造成植株萎蔫，茎部维管束的褐变超过土壤线1 m；② 适宜的土壤温度不同。番茄颈腐根腐病最适发病土壤温度为18 ℃左右，而枯萎病为27 ℃左右；③寄主范围不同。番茄枯萎病病原菌只能侵染番茄，而颈腐根腐病病原菌除了能够侵染番茄外，还能侵染豆科、葫芦科、藜科的一些植物（耿丽华 等，2012）。

番茄颈腐根腐病病原菌能够通过土壤、根、叶片直接接触传播，通常病原菌通过伤口或新生根产生的自然孔洞侵染植株。该病害侵染周期较长，如果定植后感染，病症一般在开始收获前才得以表现；如果在育苗期间感染，病症一般在开花时表现（刘蕾和王辉，2016）。此外，土壤pH 低、氨态氮以及土壤积水都能导致颈腐根腐病病情加重（Roberts et al.，2001）。该病原菌产生的小分生孢子以及厚垣孢子在病原菌的生长和传播中起到了重要作用。坏死的组织中能够产生大量的小分生孢子，它们能够通过空气流通传播，易使杀过菌的土壤发生二次感染（Rekah et al.，1999）；厚垣孢子有更厚的细胞壁，使其能够在土壤或者木质中存活更长的时间。该病原菌在无植物根系的土壤中传播能力很弱，但能够通过染病的植株以及土壤、农事操作人员和农业机械等生产设备携带的厚垣孢子进行长距离的传播（Rekah et al.，2000）。

3 番茄颈腐根腐病的病原菌鉴定

对病原菌进行分离与鉴定是确定病害类型和进行病害治理的前提。植物病原菌传统的鉴定方法通常从植株发病症状、病原菌形态特征、分子生物学鉴定和致病性测定等方面展开。

3.1 病原菌形态特征

耿丽华等（2012）、李景富等（2018）对影响番茄颈腐根腐病病原菌生长的环境条件进行了研究，发现该病原菌产孢最适培养基为PDA 培养基，碳源为葡萄糖，最适生长温度为25 ℃，致死温度为63 ℃，最适pH 值为8。该病原菌在PDA 培养基上呈淡紫灰色、白色或粉色，菌落圆形，平铺生长，菌丝绒毛状。25 ℃条件下在PDA 培养基上黑暗培养5 d，菌落直径60 mm 左右（耿丽华 等，2012）。病原菌主要产生3 种类型的孢子：大分生孢子、小分生孢子和厚垣孢子。大分生孢子镰刀形，长度20～25 μm，以3 个隔膜为主；小分生孢子长椭圆形或纺锤形，长度4～8 μm，通常无隔，是主要传播形态；厚垣孢子为透明状球形，顶生或间生，多为单独生长，偶尔也对生或串生；分生孢子梗短、生于菌丝侧面，单生，无分枝（耿丽华 等，2012；李景富 等，2018）。

3.2 病原菌分子生物学鉴定

近几年随着分子生物学发展，PCR 检测技术在病原菌检测领域得到了广泛应用。利用真菌核糖体基因转录间隔区（ITS）通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）对番茄颈腐根腐病病原菌的rDNA-ITS 区进行PCR 扩增，可得到大小约500 bp 的片段，该引物在尖孢镰刀菌的鉴定中得到广泛应用。但是尖孢镰刀菌不同专化型在rDNA-ITS 区段序列上差异性较小，因而该通用引物无法区分尖孢镰刀菌种内不同专化型及生理小种。Hirano 和Arie（2006）根据尖孢镰刀菌中多聚半乳糖醛酸酶基因设计特异性引物sprl来区分番茄颈腐根腐病病原菌Forl、番茄枯萎病病原菌Fol，以及Fol 的3 个生理小种，利用该引物通过PCR 可在Forl 小种中扩增出947 bp 大小的条带，而其他小种均不能扩增产生条带。

3.3 病原菌致病性测定

分子生物学鉴定难以区分致病与非致病菌株，Carmona 等（2020）在采集组织标本分离尖孢镰刀菌致病菌株时，发现非致病尖孢镰刀菌菌株同时存在，且存在的比例较高。因此，进行病原菌致病性测定是植物病原菌鉴定中必不可少的环节。将从田间病株分离获得的病原菌于健康植株上进行回接，发病后取寄主病健交界处组织进行再分离，根据回接后寄主发病症状和再分离获得的病原菌形态特征来确定病原菌种类。番茄颈腐根腐病病原菌（Forl）的寄主范围很广，区别于只侵染番茄的枯萎病病原菌（Fol），它不仅能够侵染番茄，还能侵染辣椒、茄子、黄瓜、菜豆等其他作物，这为Forl 与Fol的区分提供了有力证据（Rowe，1980；Menzies et al.，1990；耿丽华 等，2012）。

4 番茄颈腐根腐病的抗性鉴定

室内苗期人工接种鉴定是种质资源抗病性鉴定的重要方法之一，其优点在于可以有效控制环境因子，且保证寄主只被单一病原菌侵染，同时能够避免因病原菌蔓延而造成的生产影响，因此得到育种工作者的普遍重视。浸根法是目前进行番茄颈腐根腐病接种最常用的方法（Mutlu et al.，2015；Kim et al.，2016；Devran et al.，2018），具体操作过程：将分离纯化的病原菌接种到PDA 液体培养基中，置于摇床中以25 ℃、120 r · min振荡培养3 d，或在PDA 平板上25 ℃暗培养7 d，将菌体刮入无菌水中，过滤除去菌体，配制浓度为1 × 10个 · mL的孢子悬浮液。待番茄幼苗2～3 片真叶完全展开时，用清水将根系清洗干净，放在孢子悬浮液中进行浸根接种处理15 min，然后移栽至灭菌基质中，对照组用清水浸根15 min，接种后置于18～22 ℃室内环境中，16 h · d光照条件下培养。接种处理3～4 周后，观察、记录材料的发病情况。除浸根法外，研究者还探索了茎基部注射接种法（姜景彬等，2018）、棉球接种法（李景富 等，2018）和灌根法（李潇 等，2019）。王梦蕊等（2022）研究发现，采用不同的人工接种方法番茄颈腐根腐病的发病情况有所不同。浸根法和灌根法相较于注射法效果较好，浸根法操作技术要求相对较低，菌液可以多次使用，对菌液量要求少，适合大规模的抗性资源筛选；而灌根法是在前人研究的基础上进行了改良，对植株根系进行处理后使其存在伤口而更容易被病原菌侵染，该方法省时省力，但对菌液量要求极大，适合对少量材料进行接种鉴定；注射法操作技术要求较高，且病情指数不同重复间偏差较大，推测可能是因为注射进幼苗茎基部的菌液溢出，导致无法定量每个单株注射的菌液量，从而影响试验结果，另外不同操作者的接种效果也可能不同，因此该方法并不适合大批量材料的鉴定。

5 番茄抗颈腐根腐病的遗传学研究进展

番茄颈腐根腐病侵染周期相对较长，目前还没有十分安全有效的防治方法（Liu et al.，2010），所以对于该病害最科学有效的防治方法就是选育抗病品种。已有研究表明，番茄颈腐根腐病抗性来源于野生秘鲁番茄（）材料PI126944、PI128650 和PI126926，由显性单基因控制，该基因已被定位到9 号染色体上（Vakalounakis，1988；Laterrot &Moretti，1991；Vakalounakis et al.，1997；Fazio et al.，1999），并且被转育到栽培番茄中（Scott &Jones，2000）。日本研究者利用PI126944 将其抗性转育至栽培番茄IRB#301 中（Yamakawa &Nagata，1975），法国研究者利用PI126926 育成了抗性栽培番茄Moperou（Elkind et al.，1988），而美国研究者利用IRB#301育成了抗性栽培番茄Fla.7226、Fla.7464、Fla.7775和Fla.7781 等（Scott &Jones，2000）。近年来，国外先后选育了多个抗病番茄品种，如以色列海泽拉种子公司的罗拉、圣罗兰、安纳西，美国圣尼斯种子公司的SV4224TH 等；然而国内在番茄抗颈腐根腐病品种选育方面研究比较缓慢，目前在生产上尚没有综合农艺性状表现优良的抗病品种（刘蕾和王辉，2016）。程琳等（2016）利用人工接种鉴定病原菌的方法对25 份番茄种质材料进行抗病性鉴定，确定了其中对颈腐根腐病表现抗性的21 份材料，这些材料可用于今后的番茄抗病育种工作中。

国外研究者在基因的遗传定位和分子标记的开发方面做了很多工作。Vakalounakis 等（1997）研究认为，番茄抗颈腐根腐病基因与抗烟草花叶病毒基因-连锁，二者遗传距离为（5.1 ±1.07）cM。随 后，Fazio 等（1999）确定了9 号染色体上与分子标记的遗传顺序为TG101-UBC655-UBC116-UBC194-，但由于UBC194为RAPD 标记，检测结果不易区分，且与基因距离为5.1 cM，因此其应用受到了一定的限制（Tanyolaç &Akkale，2010）。Staniaszek 等（2014）将距离基因约3 cM 的C2_At2 g38025 标记改造成了CAPS 标记C2-25，该标记在番茄颈腐根腐病抗病材料的分子辅助选择中得到了一定的应用（程琳 等，2016，2021；刘蕾 等，2018），然而王梦蕊等（2022）采用100 份不同背景来源的番茄种质材料进行验证，该标记的吻合率仅为59%，与程琳等（2016）采用25 份材料验证的吻合率100%差距较大，其原因可能在于程琳等（2016）试验中所检测的材料均引自荷兰，其遗传背景较为单一，因此分子标记检测结果与人工接种鉴定结果高度吻合，而王梦蕊等（2022）所用试验材料为收集保存的自然群体及不同来源的新品种，遗传背景较为复杂，因此该标记准确率较低。Mutlu 等（2015）利用只携带基因，而不含-基因的材料Fla.7781构建群体，筛选获得了1 个SCAR 标记SCAR，该标记距离基因仅0.016 cM，位于9 号染色体的61.78 Mb 位置，与标记C2-25 的物理位置（5.49 Mb）较远，然而在43 份商品种番茄材料中验证其准确率不到45%（Kim et al.，2016）。在王梦蕊等（2022）的验证试验中，该标记的准确率也仅有51%，表明该标记不适用于抗颈腐根腐病的辅助选择育种。Kim 等（2016）筛选了2 个与连锁的分子标记PNU-T1212（5.1 Mb）和PNU-D4（6.1 Mb），在F群体中的准确率分别为93.2%和92.8%，但在60 份商品种番茄材料中的准确率约为60%和90%。在王梦蕊等（2022）的验证试验中，标记PNU-D4 的准确率为83%。Devran 等（2018）通过基因组重测序和生物信息学分析将基因定位在9 号染色体4.2～5.1 Mb 范围内，并分析了定位区间内的注释基因，但该研究并没有预测或验证候选基因功能。到目前为止，对于基因的定位和分子标记的应用，不同研究者的试验结果并不一致，因此还需进一步加强基因的定位克隆和分子标记开发研究工作。

6 展望

番茄颈腐根腐病病原菌与番茄枯萎病病原菌相比，虽然同为尖孢镰刀菌，但其寄主范围更广，危害范围更大。对此，番茄生产者应给予高度重视，特别是要注意合理安排不同作物的换茬轮作。近年来，我国设施番茄栽培面积逐年增大且往往连续种植，该病一旦流行将会给番茄生产造成严重损失，应密切监测颈腐根腐病在番茄主栽区的发生、发展情况，为该病害的发生做好预防和控制工作。

目前，我国在番茄抗颈腐根腐病方面的研究相对薄弱，主要集中在病原菌鉴定和病害防治方面，在遗传学研究方面基本处于空白，因此极大地阻碍了番茄抗颈腐根腐病的育种进程。另有研究表明，较早应用到抗病育种中的秘鲁番茄PI128650同时携带有抗病基因-和，对348 份栽培番茄材料基因组重测序显示，其中20 份材料携带有秘鲁番茄9 号染色体上长约50 Mb 的片段，该外源野生片段占据了9 号染色体的大部分区域（Lin et al.，2014）。由于野生番茄和栽培种番茄存在结构变异（Seah et al.，2004；Ji et al.，2007），在长期的自交和回交选育过程中，该外源片段依旧没有完全被打断，这种情况可能会导致在番茄抗烟草花叶病毒病和颈腐根腐病育种中产生很多不良性状，比如某些携带-抗性基因的番茄材料会表现为植株长势较弱，叶片发黄等（崔丽朋 等，2017）。抗性基因连锁累赘是培育优质多抗番茄品种的主要障碍，这可能是目前生产上没有综合农艺性状表现优良的抗颈腐根腐病番茄品种的重要原因之一。如何通过全基因组分子设计育种和利用分子标记辅助选择打破抗病基因连锁累赘，是现今培育优质多抗番茄品种的重点和难点，研究者应加强抗病基因的定位和克隆等工作，为番茄抗病新品种的培育奠定基础。