潘 婷,彭倩文,杜艳芸,王晨辉,2,3*

(1.华中科技大学生命科学与技术学院,中国湖北 武汉 430074;2.四川省医学科学院四川省人民医院人类疾病基因研究四川省重点实验室,中国四川 成都 610031;3.电子科技大学,中国四川 成都 611731)

2019年底出现的新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019,COVID-19)在国内和国际上的快速传播导致了全球卫生紧急事件。严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)入侵宿主细胞首先依赖于病毒刺突蛋白S(spike glycoprotein)与细胞表面受体血管紧张素转换酶2(angiotensinconverting enzyme 2,ACE2)的结合,随后宿主细胞蛋白酶对S蛋白进行切割激活,进而促进病毒与宿主细胞膜融合,ACE2与宿主细胞蛋白酶在病毒入侵宿主细胞的过程中都发挥了关键作用[1]。Glowacka等[2]曾报道,Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶(type Ⅱ transmembrane serine protease,TMPRSS2)的分布与SARS-CoV在肺部的感染相关,该蛋白酶可以有效地激活冠状病毒的S蛋白,在细胞表面诱导病毒与细胞膜融合。

1997年,TMPRSS2基因通过系统外显子捕获实验在人类21号染色体上首次被发现。其全长cDNA编码由492个氨基酸组成的蛋白质[3],该蛋白质固定在质膜上,属于TTSPs家族(Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶)。TTSPs的特征是包含一个短的细胞内N端结构域、一个跨膜结构域和一个大的胞外结构域,其中胞外结构域由一个可变茎区和一个糜蛋白酶S1折叠的C端丝氨酸蛋白酶结构域构成[4～5]。根据丝氨酸蛋白酶结构域的茎区组成和系统发育分析,TTSPs被分为人气道胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶(human airway trypsin-like protease,HAT)、蛋白质裂解酶(matriptase)、跨膜丝氨酸蛋白酶(TMPRSSs)和丝氨酸酶4个亚家族[6]。

SARS-CoV-2是一种主要通过呼吸途径传播的急性传染病的病原体。尽管ACE2存在于所有器官的血管内皮细胞中,但SARS-CoV和SARSCoV-2仅在肺部具有高致病性[7～8]。此外,虽然在Ⅰ型和Ⅱ型肺细胞中均有ACE2的表达[9],但SARSCoV-2的细胞向性与ACE2的表达并不严格相关,这表明COVID-19的发病机制还需要其他因素来解释[9]。TMPRSS2在人肺的上皮细胞中高度表达[10]。已知各种蛋白酶,如胰蛋白酶、类胰蛋白酶、人气道胰蛋白酶和TMPRSS2,都能够裂解甲型流感病毒血凝素的糖蛋白,并且TMPRSS2是病毒和宿主细胞膜融合的先决条件[11]。许多病毒,如人类免疫缺陷病毒(HIV)和尼帕病毒,在感染细胞过程中由细胞蛋白酶(如弗林蛋白酶或组织蛋白酶)切割病毒糖蛋白,从而分离病毒的受体结合亚基和膜融合亚基,并将糖蛋白前体转化为融合状态[12]。对于埃博拉病毒和SARS冠状病毒,病毒糖蛋白被内吞体蛋白酶裂解,在病毒进入细胞过程中,诱导受体结合或内吞作用导致的构象变化[13]。有3种蛋白酶,即胰蛋白酶、组织蛋白酶L和弹性蛋白酶,曾被报道能够激活SARS冠状病毒的S蛋白[14～16]。在细胞表面缺乏上述蛋白酶的情况下,SARS冠状病毒通过内吞体途径进入细胞,S蛋白被内吞体中的组织蛋白酶L激活[17～18]。相反,在细胞表面存在上述蛋白酶(如胰蛋白酶和弹性蛋白酶)时,附着在宿主细胞表面受体上的病毒S蛋白会被这些蛋白酶激活,诱导包膜-质膜融合,随后介导SARS冠状病毒直接进入细胞[19]。后一种情况下的病毒复制效率更高,比内吞体途径的复制效率高100倍[19],这表明,SARS冠状病毒引起的严重急性呼吸道综合症可能是蛋白酶介导的病毒直接进入细胞导致的复制增强。

TMPRSS2在病毒感染宿主细胞的过程中发挥重要作用。类似地,人偏肺病毒(human metapenumovirus,HMPV)的融合蛋白F是作为单一表面糖蛋白合成的,需要被宿主细胞蛋白酶裂解才能使病毒繁殖[20]。这种病毒主要在幼儿中引起严重的毛细支气管炎和肺炎。既往研究表明,TMPRSS2是HMPV F蛋白的有效激活剂[21]。此外,研究还发现,除了组织蛋白酶L外,TMPRSS2也能激活SARS-CoV的刺突蛋白S[22]。TMPRSS2对S蛋白的切割促进了SARS冠状病毒从细胞表面直接进入宿主细胞,而不依赖于内吞体途径中组织蛋白酶L的活性[23]。之前的一项研究发现,非特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂camostat处理后,SARS冠状病毒对Calu3细胞的感染相比较未处理的对照组降低了90%[24]。

基于以上信息,我们推测TMPRSS2可能成为抗SARS-CoV-2感染的潜在靶点。我们前期通过研究TMPRSS2蛋白酶存在的几种形式,发现TMPRSS2会通过自剪切发挥酶活,并且确认了野生型TMPRSS2在具有酶活的状态下仍然锚定在膜上,提示TMPRSS2可以作为一种阻断病毒进入的细胞表面靶点。因此,我们纯化了酶活位点和剪切位点双突变的TMPRSS2重组蛋白,该重组蛋白通过与Calu3细胞表面具有酶活性的TMPRSS2竞争性结合SARS-CoV-2的S蛋白,抑制宿主细胞表面的TMPRSS2对病毒S蛋白的裂解激活,从而阻断病毒与宿主细胞的膜融合,进而阻断SARS-CoV-2的感染。

1 材料与方法

1.1 细胞系

人胚肾细胞系HEK293T购自武汉普建生物科技有限公司,在37℃、5%CO2培养条件下,传代于有1%青霉素-硫酸链霉素和10%胎牛血清的高糖 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)培养基中。人肺腺癌细胞系Calu3购于上海富衡细胞库,在37℃、5%CO2培养条件下,传代于有1%青霉素-硫酸链霉素和10%胎牛血清的高糖 MEM(Modified Eagle’s Medium)培养基中。HeLa细胞购自美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection,ATCC),在 37℃、5%CO2培养条件下,传代于有1%青霉素-硫酸链霉素和10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中。人结肠腺癌细胞系Caco2购自ATCC,在37℃、5%的CO2培养条件下,传代于有1%青霉素-硫酸链霉素、10%胎牛血清和1%丙酮酸钠的MEM培养基中。人胚肾悬浮细胞FreeStyleTM293F购于赛默飞世尔科技公司,利用缓冲底三角培养瓶,在37℃、5%的CO2、120 r/min悬浮培养箱条件下,传代于FreeStyleTM293F表达培养基中。

1.2 质粒构建

PLVX-FLAG-TMPRSS2-Puro购自武汉淼灵生物科技有限公司,在它的基础上将255位氨基酸AGG点突变为CAG,得到PLVX-FLAG-TMPRSS2-R255Q-Puro质粒,在此突变的基础上将441位氨基酸AGT点突变为GCT,得到PLVXFLAG-TMPRSS2-R255Q+S441A-Puro。随后,以双突变的PLVX-FLAG-TMPRSS2-R255Q+S441APuro为模板,使用限制性内切酶Sac Ⅰ(GAGCTC)和Xho Ⅰ(CTCGAG),将双突变的TMPRSS2构建到pINFUSE-hIgG2-FC蛋白表达载体(购自Invivo-GEN公司)上。所需引物见表1。

表1 主要引物信息Table 1 The sequences of primers in this study

1.3 TMPRSS2重组蛋白的表达和纯化

为制备TMPRSS2(106-492)R225Q+S441A-FC蛋白,将293F细胞扩培至300 mL,当密度达到2×106mL-1时平均分到两个摇瓶中,每个摇瓶中150 mL,向每个摇瓶中各补120 mL新鲜培养基至270 mL的终体积。随后,使用转染试剂Polyplus FectoPRO(购自法国Polyplus Transfection公司),按照如下条件:转染的质粒(μg)∶总培养基(mL)=1∶2;转染试剂(μL)∶质粒(μg)=1.5∶1;辅助转染试剂Booster在培养基中的用量为0.45 μL/mL,瞬时转染表达质粒pINFUSE-TMPRSS2(106-492)R225Q+S441A-hIgG2-FC(含该蛋白质编码序列)。处理3 d后,检测细胞活率,收集部分上清液,初步检测蛋白质在上清中的表达;6 d后,收集上清液,用Protein G柱(GE Healthcare)经亲和层析纯化可溶性蛋白。

1.4 免疫印迹

向瞬时转染了TMPRSS2三种突变体的HEK-293T细胞中加入IP-Buffer裂解液(本实验室配制),冰上裂解30 min。12 000 r/min离心10 min,取上清液到新的EP管中,弃沉淀,加适量的5×上样缓冲液(本实验室配制),95℃加热5 min,通过SDSPAGE将蛋白质条带分离开来。将凝胶上的蛋白质条带转移到甲醇激活的PVDF膜上,转膜完成后分别使用脱脂牛奶封闭1 h,采用特异性的一抗(图1A中的一抗为购自日本GNI公司的anti-Flag monoclonal antibody;图1B中的一抗为购自武汉普建生物科技有限公司的anti-mouse IgGFC antibody),按照1∶1 000的比例用脱脂牛奶配制后于4℃孵育过夜,利用对应的二抗(图1中的二抗都是购自赛默飞世尔科技公司的goat antimouse IgG(H+L)secondary antibody,HRP),按照1∶2 000的比例用脱脂牛奶配制后在常温孵育2 h,随后使用化学发光显影液,将PVDF膜置于ChemiDocTMXRS+化学发光成像系统进行曝光,结果图片使用Image Lab进行分析。

1.5 免疫荧光显微技术

将HeLa细胞种至直径1.5 cm的孔板中,待细胞密度达到40%～50%时,用pH 7.4的磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗涤。用4%多聚甲醛固定细胞30 min,再用0.5%Triton X-100溶液处理细胞20 min,然后加入5%的牛血清白蛋白(bovine albumin,BSA)作为阻断缓冲液,室温封闭1 h。加入用5%BSA溶液稀释的一抗(1∶1 000)于4℃孵育过夜,吸弃一抗后,加入带荧光的二抗FITC。实验所用的一抗为AbclonalhTMPRSS2 Ab,相应的FITC标记的二抗(1∶500)购自Beyotime Biotechnology。细胞核使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)于室温下避光染色15 min,然后在OLYMPUS FV3000共聚焦显微镜下进行观察。

1.6 SARS-CoV-2假病毒的包装

SARS-CoV-2假病毒是使用VSV假病毒系统生产的[25]。在转染前一天,制备HEK293T细胞,调整细胞密度为5×105mL-1,其中15 mL转入T75细胞培养瓶中,在37℃、5%的CO2条件培养箱中孵育过夜。当过夜培养的细胞达到70%～90%的密度时,将表达刺突蛋白S的DNA质粒(购自北京义翘神州科技有限公司)与psPAX2(购自Addgene公司)、pLenti-Luc2(购自武汉淼灵生物科技有限公司)按照1∶1∶2的质量比进行转染。6 h后,用新鲜的含有1%青霉素-硫酸链霉素和10%胎牛血清的高糖DMEM培养基替换,再孵育36 h,收集含有假病毒的培养上清液,离心后过滤(孔径为0.45 μm),并在-80℃下保存待用。

1.7 感染程度的测定

在假病毒的包装过程中,我们将荧光素酶的序列加入到系统,故该假病毒也可以表达荧光素酶,该荧光素酶可以与荧光素酶的底物反应,通过荧光强度显示病毒感染细胞的效率。假病毒感染前24 h,将HEK293T、Calu3或Caco2细胞接种于96孔板(JET BIOFIL),每孔1×104个细胞。待第2天细胞贴壁后,将包装好的假病毒上清每孔100 μL加入到种好细胞的96孔板内,细胞培养箱中培养36 h后,吸弃上清,再向96孔板中每孔加入30 μL的细胞裂解液,冰上裂解30 min,随后收集裂解液到1.5 mL EP管中,12 000 r/min离心5 min,取5 μL上清液与荧光素酶底物20 μL混合,15 s内用LUMINOMETER机器检测混合物的荧光。

1.8 中和实验测试

在假病毒感染前,每孔1×104个Calu3细胞接种于96孔板(JET BIOFIL)。将TMPRSS2重组蛋白按照30 μg/mL的量加入Calu3细胞中。37℃孵育1 h后,将100 μL的SARS-CoV-2假病毒加入混合物中孵育36 h。取荧光素酶底物(20 μL/孔)至1.5 mL EP管中,再向EP管中加5 μL细胞裂解上清。混匀后将EP管转移到LUMINOMETER中,通过测定生物发光来确定其感染能力。

1.9 数据分析

所有数据用平均值±标准差(x±s)表示。多组间比较采用单因素方差分析,显著性水平为P＜0.05。采用Prism计算机软件制图。

2 结果

2.1 TMPRSS2突变体的构建及蛋白质纯化

报道显示,TMPRSS2的实际裂解位点是Arg-255-Ile-256键,如果蛋白酶活性结构域催化三联体中的第441位丝氨酸突变为丙氨酸(S441A),则TMPRSS2失去蛋白酶活性[26]。

基于这一报道,我们构建了TMPRSS2突变体重组蛋白。该重组蛋白不具有蛋白酶活性,也不会发生自剪切,是TMPRSS2全长的胞外段。我们在HEK293T中分别过表达野生型和突变型的TMPRSS2,结果显示,在野生型的TMPRSS2(WTTMPRSS2)中明显观察到细胞相关的C端切割片段,但在TMPRSS2的R255Q(剪切位点)突变体和S441A(酶活位点)突变体以及二者的双突变体中只能观察到很少的切割(图1A),这证实了TTSPTMPRSS2的剪切形式确实是通过自催化活性产生的。我们在HEK293T中过表达R255Q、S441A和R255Q+S441A这3种TMPRSS2突变体蛋白质,发现这3种蛋白质大多数都作为全长70 kD的酶原形式存在(图1A)。该结果与之前的报道相一致,TTSPs是作为非活性的单链原酶(酶原)合成的,在运输到细胞表面期间或之后发生自裂解,形成活性形式[26～27]。

随后,我们在真核细胞293F中表达双突变体的TMPRSS2蛋白,转染6 d后收集细胞上清,发现双突变的TMPRSS2重组蛋白能正常表达,并且以全长二聚体的形式分泌到上清中(图1B)。

图1 TMPRSS2突变体的构建及蛋白质纯化(A)TMPRSS2的自剪切形式。将野生型TMPRSS2及3种突变体瞬时转染进HEK293T细胞,48 h后收集细胞冰上裂解,Western-blot技术分析带FLAG标签的几种TMPRSS2突变体蛋白质条带的位置,最右侧条带为蛋白质marker;(B)TMPRSS2重组蛋白的纯化。将构建成功的(从左到右)WT-TMPRSS2-FC、TMPRSS2-R255Q-FC、TMPRSS2-S441A-FC和TMPRSS2-R225Q+S441A-FC的pINFUSE表达质粒转染到293F细胞中,6 d后收集细胞培养上清,提纯蛋白质后进行Westernblot分析,最右侧条带为蛋白质marker。Fig.1 Construction and protein purification of TMPRSS2 mutant(A)Self-shearing form of TMPRSS2.The wild-type TMPRSS2 and three mutants were transiently transfected into HEK293T cells.The cells were collected for ice lysis 48 h later.The TMPRSS2 mutants labeled with FLAG were analyzed by Westernblot.The rightmost lane is the protein marker;(B)Purification of TMPRSS2 recombinant protein.The constructed pINFUSE plasmids expressing WT-TMPRSS2-FC,TMPRSS2-R255Q-FC,TMPRSS2-S441A-FC and TMPRSS2-R225Q+S441A-FC were transfected into 293F cells.Six days later,the purified proteins were collected from the supernatants of cell cultures and analyzed by Western-blot.The right most lane is the protein marker.

2.2 假病毒感染宿主细胞体系的建立

为了研究纯化的TMPRSS2突变体重组蛋白对SARS-CoV-2的抑制活性,我们在体外构建了假病毒感染细胞的体系:构建SARS-CoV-2 S蛋白携带水疱性口炎病毒(ΔG-VSV/荧光素酶)假病毒用作细胞感染。VSVG(疱疹性口腔炎病毒糖蛋白G)是一种包膜蛋白,因为这种抗原在很多细胞表面都能找到对应的受体,所以这个包膜蛋白具有广泛的宿主范围。病毒通过包膜蛋白与宿主细胞识别后,继而通过内吞作用进入细胞。因此,本研究使用VSVG作为病毒能够感染进宿主细胞的阳性对照。

用包装好的VSVG和SARS-CoV-2假病毒分别感染HEK293T细胞系、Calu3细胞系和Caco2细胞系。曾有文献报道,ACE2的融合蛋白对病毒感染具有显著的阻断效果[28]。因此我们使用纯化的人的ACE2融合蛋白作为阻断病毒感染的阳性对照。图2的结果显示:在HEK293T细胞系和Calu3细胞系中,病毒感染率较高,且感染能被ACE2融合蛋白显著阻断。相关文献报道,Calu3细胞系中有内源性的TMPRSS2稳定表达,而HEK239T中没有TMPRSS2的表达[1];在本研究中,图2的结果显示,假病毒感染Caco2细胞的效率较低。因此,我们最终选定Calu3细胞系作为TMPRSS2研究的主要细胞载体,并使用目前的病毒感染体系用于后续的研究。

图2 假病毒感染宿主细胞体系的建立SARS-CoV-2假病毒是使用VSV假病毒系统生产的[25]。用包装好的VSVG和SARS-CoV-2假病毒依次感染HEK293T、Calu3和Caco2这3种细胞系,将hACE2-Fc融合蛋白按照30 μg/mL的量加入宿主细胞以阻断SARS-CoV-2假病毒的感染,vector和VSVG分别用作病毒感染进细胞的阴性和阳性对照(***:P＜0.001;****:P＜0.000 1)。Fig.2 Establishment of host cell system infected with pseudovirusSARS-CoV-2 pseudovirus was produced using VSV pseudovirus system[25].The HEK293T,Calu3 and Caco2 cell lines were infected with packaged VSVG and SARS-CoV-2 pseudovirus successively.The hACE2-Fc fusion protein was added into host cells at a concentration of 30 μg/mL to block the infection of SARS-CoV-2 pseudovirus.The vector and VSVG were used as negative and positive controls,respectively,for virus infection of cells(***:P＜0.001;****:P＜0.000 1).

2.3 TMPRSS2重组蛋白能够阻断SARS-CoV-2假病毒的感染

相关研究报道,非特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂camostat处理,可使SARS冠状病毒对Calu3细胞的感染相比较未处理的对照组降低90%[24]。这在我们的实验结果中也得到了证实:camostat抑制剂能够显著阻断SARS-CoV-2假病毒感染细胞(图3A)。图3B显示,我们纯化的人的R255Q和S441A双突变TMPRSS2重组蛋白(hTMPRS-S2-Fc)也能抑制SARS-CoV-2病毒的感染,但是其抑制效果并不像camostat抑制剂那样显著,其原因可能是:在病毒感染的过程中,S蛋白的激活除了依赖TMPRSS2蛋白酶,还有可能依赖其他的蛋白酶,例如组织蛋白酶B/L(已有文献报道,组织蛋白酶B/L的抑制剂也能有效阻断SARS-CoV-2病毒的感染)[16]。综上所述,TMPRSS2在病毒感染过程中发挥了重要的作用,很有可能成为阻断病毒感染的潜在靶点。

图3 TMPRSS2重组蛋白阻断假病毒的感染(A)TMPRSS2抑制剂阻断SARS-CoV-2假病毒感染的效果。将TMPRSS2抑制剂camostat按照2 μmol/L、10 μmol/L和50μmol/L的梯度加到铺有Calu3细胞的96孔板中,37℃孵育1 h后,将100 μL的SARS-CoV-2假病毒上清加入混合物中孵育36 h,通过测定生物发光来确定其感染能力。*:P＜0.05,**:P＜0.01;(B)TMPRSS2重组蛋白阻断SARS-CoV-2假病毒感染的效果。将TMPRSS2双突变重组蛋白和hACE2-Fc融合蛋白按照30 μg/mL的量加到铺有Calu3细胞的96孔板中,37℃孵育1 h后,将100 μL的SARS-CoV-2假病毒上清加入混合物中孵育36 h,通过测定生物发光来确定其感染能力。**:P＜0.01,****:P＜0.000 1。Fig.3 Prevention of pseudovirus infection by TMPRSS2-Fc protein(A)The blocking effect of TMPRSS2 inhibitors on pseudovirus infection.Camostat,a TMPRSS2 inhibitor,was added into the 96-well plate of Calu3 cells at a gradient level(2 μmol/L,10 μmol/L and 50 μmol/L).After incubation at 37 ℃ for 1 h,100 μL SARS-CoV-2 pseudovirus supernatant was added into the mixture and incubated for 36 h.The infectivity was determined by bioluminescence measurements.*:P＜0.05,**:P＜0.01;(B)The blocking effect of TMPRSS2-Fc protein on pseudovirus infection.The double mutanted TMPRSS2 recombinant protein and hACE2-Fc fusion protein were added into the 96-well plate of Calu3 cells at a concentration of 30 μg/mL.After incubation at 37 ℃ for 1 h,100 μL SARS-CoV-2 pseudovirus supernatant was added into the mixture and incubated for 36 h.The infectivity was determined by bioluminescence measurements.**:P＜0.01,****:P＜0.000 1.

2.4 野生型TMPRSS2定位在HeLa细胞表面

TMPRSS2是Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶,属于TTSPs家族,表达在细胞质膜上,其丝氨酸蛋白酶活性区域位于C端胞外段[3]。TMPRSS2作为一种膜蛋白,在病毒入侵宿主细胞时发挥酶活,切割并激活病毒的S蛋白。我们假设TMPRSS2作为一种膜蛋白,能够成为宿主细胞表面阻断病毒感染的靶点。因此,我们在HeLa细胞中过表达野生型的TMPRSS2,并使用TMPRSS2的特异性一抗与HeLa细胞孵育,随后用FITC绿色荧光二抗标记TMPRSS2,最后在FV3000共聚焦显微镜下观察TMPRSS2的细胞定位情况。我们发现,野生型的TMPRSS2定位在细胞膜表面(图4),证明TMPRSS2在细胞膜上的稳定表达确实能够作为阻断病毒入侵的潜在靶点,这为未来针对TMPRSS2的药物研发提供了新的思路。

图4 野生型TMPRSS2定位在HeLa细胞表面瞬时转染PLVX-M2-FLAG到HeLa细胞,使用Abclonal-hTMPRSS2 Ab一抗及相应的FITC标记的二抗进行免疫荧光染色,然后在FV3000共聚焦显微镜下进行观察。比例尺:5 μm。Fig.4 Wild-type TMPRSS2 localization on the surface of HeLa cellsPLVX-M2-FLAG was transiently transfected into HeLa cells.The primary antibody was Abclonal-hTMPRSS2 Ab,and the corresponding FITC-labeled secondary antibody was used for immunofluorescence staining.Then observation was performed under FV3000 confocal microscope.Scale bar:5 μm.

3 讨论

本研究表明,TMPRSS2双突变的重组蛋白能有效抑制SARS-CoV-2假病毒感染Calu3细胞,这和非特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂camostat的功能基本一样,二者都能够有效抑制SARS-CoV-2假病毒感染细胞。有报道称,在TMPRSS2敲除的细胞中,SARS-CoV的S蛋白可以利用内吞体半胱氨酸蛋白酶CatB/L启动S蛋白[16]。然而,由TMPRSS2,而不是CatB/L,启动的S蛋白是病毒通过受体进入原代靶细胞感染宿主细胞的必要条件[1]。我们的研究发现,SARS-CoV-2假病毒感染Calu3细胞能够被TMPRSS2重组蛋白和camostat不同程度的抑制,但不能完全阻断,这可能是因为除了TMPRSS2以外,CatB/L也可以激活SARSCoV-2的S蛋白,从而促进SARS-CoV-2病毒的感染[16]。总的来说,根据已有的文献,TMPRSS2是一种宿主细胞因子,对包括甲型流感病毒和冠状病毒在内的几种临床相关病毒的传播至关重要[29～30];相比之下,TMPRSS2对于宿主细胞的发育和稳态并不是不可或缺的[31],因此,封闭或者干涉TMPRSS2的功能为抗新型冠状病毒感染的研究提供了新的思路。虽然丝氨酸蛋白酶抑制剂camostat可以阻断TMPRSS2的活性,在日本也已被批准用于人新型冠状病毒感染治疗的临床试验,但患者出现了严重的副反应。因此,该化合物仍需进行改构以降低副作用,从而用于治疗SARS-CoV-2感染患者[32]。相比较之下,TMPRSS2蛋白显示出较好的阻断效果。TMPRSS2重组蛋白的治疗可能规避掉抑制剂化合物对人体造成的严重副作用。在未来,研究人员还可以筛选出TMPRSS2特异性的封闭抗体,从而阻断病毒的感染。总之,该研究为阻断SARS-CoV-2感染的第一步——病毒进入细胞提供了新的见解,并确定了TMPRSS2很有可能成为抗新型冠状病毒干预的潜在靶点。