李趁趁，夏 荣，庞诗梦，余金兰

种植义齿因良好的远期稳定性成为牙缺失的常规修复方式，而预防种植体周围疾病的发生是其长期存留的关键。Lee et al[1]研究表明种植体周围疾病的发病率约为47%，种植体周围黏膜炎和周围炎分别约为29.48%和9.25%。种植体周围炎的发生与牙周炎相似菌斑生物膜为始动因子，牙龈卟啉单胞菌是致病菌[2]。两段式种植体中，种植体-基台连接处的微间隙会成为细菌储存库[3-4]，赋予基台一定的抗菌能力会有助于种植体周围炎的预防。葡萄糖酸氯己定(chlorhexidine gluconate，CHXG)是临床常用的抗菌剂之一，聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)含有硅氧硅(Si-O-Si)结构，可与钛表面的羟基官能团结合，聚硅氧烷单元上的烷基链可通过范德华作用力捕获CHXG[5-7]。该研究通过浸渍提拉法使PDMS与光滑的钛表面结合，然后浸泡在CHXG溶液中，实现钛表面抗菌涂层PDMS-CHXG的构建并探究不同浓度CHXG的抗菌性能。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器医用钛片(TA1)(宝鸡泰宇鑫金属材料有限公司)；Sylgard 184(聚二甲基硅氧烷，美国Dow corning公司)；20%葡萄糖酸氯己定溶液(美国Sigma-Aldrich公司)；牙龈卟啉单胞菌(北京百欧博伟生物技术有限公司)；脑心浸液培养基(brain heart infusion，BHI)、琼脂粉、无菌脱纤维山羊血(上海索莱宝生物科技有限公司)；结晶紫溶液、抗荧光淬灭剂、氯化血红素(上海碧云天生物技术有限公司)；维生素K1注射液(安徽长江药业有限公司)； DMAO/EthD-Ⅲ活/死细菌染色试剂盒[翌圣生物科技(上海)有限公司]；HITACHI SU8220冷场发射扫描电子显微镜、LSM880激光扫描共聚焦显微镜(德国卡尔·蔡司股份公司)；麦氏比浊仪(上海梅里埃诊断产品有限公司)；多功能微孔板酶标仪(美国赛默飞世尔科技公司)。

1.2 试件制备将直径12 mm、厚1 mm的60枚钛片用砂纸逐级抛光至7 000目达到基台光滑度，分别用丙酮、无水乙醇及超纯水各超声荡洗30 min，以去除杂质获取更多-OH，碱化处理，烘干、备用。

1.3 实验分组与涂层制备将Sylgard 184以10 ∶1混合于正庚烷溶液中，恒温磁力加热搅拌器室温下搅拌30 min，然后将上述试件放置于溶液中，在超声震荡条件下浸泡30 min后均匀提拉取出，超纯水超声波清洗3 min，在60 ℃环境中烘干。随机分为5组，空白对照组为光滑钛片；实验组按CHXG浓度0、0.4、0.8、1.6 mg/ml分为4组，分别记为C、T0、T1、T2、T3。取20%CHXG溶液加入去离子水中，混匀后得到上述浓度的CHXG溶液，将试件浸泡于CHXG溶液24 h后均匀提拉取出，超纯水超声波清洗3 min，烘干，环氧乙烷灭菌后备用。

1.4 牙龈卟啉单胞菌悬液制备将牙龈卟啉单胞菌菌株划线接种在BHI琼脂平板上，在37 ℃厌氧环境(80% N2、10% CO2、10% H2)培养72 h，挑取单菌落接种于BHI血清培养基中，制备成1.5×108CFU/ml的细菌悬液。

1.5 抗菌涂层表征在各组中随机选取3枚样品使用CFESEM观察表面结构的变化，并用X射线能谱对样品表面的元素组成进行半定量分析。

1.6 抗菌性能检测

1.6.1抑菌环实验 取100 μl上述细菌悬液滴在BHI血琼脂平板上，用涂布棒均匀涂布至菌液被血琼脂平板完全吸收，每组随机选取3枚样品将正面轻轻放置于平板表面，使其与琼脂平板完全接触，37 ℃厌氧培养72 h后观察实验结果并记录。

1.6.2活/死细菌染色实验 利用DMAO/EthD-Ⅲ活/死细菌染色试剂盒鉴别样品表面活/死细菌。将DMAO ∶EthD-Ⅲ ∶0.85% NaCl溶液按1.25 μl ∶2.5 μl ∶1 ml的比例配制成荧光染液，避光备用。在超净工作台内放入24孔板，每组随机选取3枚样品将受试面朝上置于孔板内，取上述细菌悬液，每个样品表面接种100 μl，每孔加入1.5 ml BHI血清培养基，37 ℃厌氧培养72 h，弃去旧培养基。用0.85% NaCl溶液清洗5 min，去除未牢固黏附的细菌，重复3次。吸取200 μl荧光染液滴于样品表面，室温避光孵育15 min，然后用0.85% NaCl溶液清洗并滴加抗荧光淬灭剂，将样品倒置于载玻片上，激光共聚焦显微镜(×40oil)下观察。

1.6.3结晶紫染色实验 每组随机选取3枚样品将受试面朝上置于孔板内，接种菌种，37 ℃厌氧培养72 h。将样品置于另一24孔板内，PBS清洗去除悬浮细菌，2.5%戊二醛固定30 min，弃去固定液，并用PBS清洗，加入1 ml 1%结晶紫溶液振摇20 min，用PBS将游离燃料彻底清洗干净，加入1 ml 33%醋酸溶液溶解样品表面结晶紫染液，充分震荡后吸取200 μl液体于96孔板中，每个样品设3个复孔。用酶标仪测定590 nm处的吸光度(optical density，OD)值，评估样品表面抑制细菌生物膜形成的能力。

2 结果

2.1 CFESEM下观察样品表征C组钛片表面相对光滑，除了方向一致的细小划痕外无其他特殊形貌；实验组随着CHXG浓度的增加，样品表面出现了致密均一的薄膜，表明抗菌涂层使用该方法可在钛片表面成功构建。见图1。

图1 CFESEM下各组样品表面形貌变化 ×500

X线能谱进行半定量分析，结果见图2，T0组样品表面的元素组成主要为C、Si、O，从PDMS的化学结构式(C2H6OSi)n中可以看出C、Si、O为PDMS涂层的主要组成元素，表明PDMS与钛片表面的成功结合；与T0组比较，其他实验组的结果出现了Cl元素，且随着CHXG浓度的增加所占比例也增加，该分析结果也表明抗菌涂层PDMS-CHXG在钛片表面的成功构建。

图2 X射线能谱表面元素半定量分析

2.2 抗菌性能评价

2.2.1抑菌环实验结果 C、T0组样品周围未观察到抑菌环；T1-T3组样品周围抑菌环明显，且抑菌环直径随着CHXG浓度的增大而增大，当CHXG的浓度达到0.8 mg/ml时表现出良好的抗菌性能。见图3。

图3 各组样品抑菌环实验结果

2.2.2活/死细菌染色结果 C组和T0组样品表面含有大量绿色荧光(活菌)，荧光信号较强表明细菌出现了成团的黏附生长；T1-T3组随着CHXG浓度增大可以观察到红色荧光(死菌)的出现且荧光信号明显变弱，在T2、T3组几乎观察不到绿色荧光，表明随着CHXG浓度的增大细菌黏附聚集生长现象减少且几乎无活菌出现。见图4。

图4 各组样品表面活/死细菌染色免疫荧光结果 ×40oil

2.2.3样品表面细菌数量 C、T0组的OD值基本一致，随着CHXG浓度的增大，T1-T3组OD值逐渐减小。ANOVA结果表明各组间差异有统计学意义(F=5 886.13，P<0.01)。SNK检验结果显示C组与T0组间差异无统计学意义(P>0.05)；T2组与T3组间差异无统计学意义(P>0.05)；T1-T3组与C和T0组间差异有统计学意义(P<0.05)。见图5。

图5 结晶紫染色实验检测样品表面的细菌数量组间比较： *P<0.05；与C和T0组比较：#P<0.05

3 讨论

种植义齿具有与天然牙极其相似的良好生物特性，成为修复牙缺失的理想修复方式。种植体与基台的分离设计保证了种植体植入牙槽骨发生骨结合的过程中被完全封闭在牙槽骨内，避免了其与口腔内微生物的接触，从而保证形成良好的骨结合[8]，种植体周围软组织封闭的形成也会阻止外界物理和生物刺激的侵入。种植体形成稳定的骨结合后会行二期手术而暴露在口腔环境中，研究[2, 9]表明，早期炎症在种植体暴露于口腔内约3周的时间就可发生，软组织封闭形成的时间约为基台安装完成后6～8周。二期手术到终修复体完成之前，基台会被断开、重新连接多次使种植体穿龈部位的软组织封闭被破环，新的结合在短期内不能形成，口腔内的微生物及其代谢产物、食物残渣等便会入侵，基台重新连接的过程中也易将细菌和其他污染物带入种植体-基台连接处，从而引起种植体周围炎症的发生，导致种植义齿修复失败。因此，增强种植体穿龈部位的抗菌性能及在软组织封闭形成之前降低感染风险是需要考虑的关键因素。

目前，主要研究的抗菌涂层包括银离子、铜离子等金属离子，抗菌肽及广谱抗生素等，金属离子可以通过阳极氧化法、微弧氧化法或离子注入法与种植体紧密结合[10-11]，但抗菌离子容易释放不足。抗菌肽抗菌谱广且具有特异性受体，但其合成费用较高，在临床难以推广应用[12]。抗生素具有较强的抗菌性能，可抑制微生物的细胞壁和蛋白质的合成、干扰DNA转录和翻译，但会增加机体耐药的风险[13]。Wu et al[14]对N-卤胺聚合物涂层持久性和抗菌性能研究结果表明涂层的抗菌功效可持续存在12～16周，且具有可重复构建性。Lauritano et al[5]和Carinci et al[6]使用1%CHXG醇溶液作为种植体抗菌内涂层评价了其抗菌性能，结果表明涂层能够灭活通过种植体-基台连接处渗透到种植体内部的微生物，Carinci et al[6]通过临床实验对6个月时连接处微间隙内的细菌数量进行了聚合酶链式反应分析，结果表明实验组微间隙内的微生物数量减少。CHXG作为一种广谱抗菌剂，具有较强的杀菌和抑菌作用，且不易产生耐药性，临床应用前景较好，是目前研究的热点，但与钛片的结合涉及复杂的灌注程序，在临床难以推广[15]。

PDMS是应用最广泛的有机聚合物，具有惰性、无毒、良好的生物相容性等特点。本实验选择PDMS作为中间层与含有Cl这一卤族元素的CHXG结合，通过简单的浸渍提拉法在光滑钛片表面形成抗菌涂层，制备方法简便高效，以期用于临床基台抗菌性能的研究。然而本研究存在一定的局限性，选择单一菌种进行研究不能代表口腔内复杂的微生态环境；种植体周围软组织封闭的形成在种植体周围炎的预防中也至关重要，涂层对生物学宽度内半桥粒的影响将在后续的动物实验中加以完善；基台是临床上重复使用的重要配件，因此，涂层构建成功后的无损清除也值得研究。

CFESEM结果表明抗菌涂层构建成功，为了评价抗菌能力，进行了抑菌环、活/死细菌染色及结晶紫染色实验，表明涂层具有良好的抗菌性能，本课题组细胞相容性实验用牙龈成纤维细胞验证了其生物相容性良好。种植义齿修复过程二期手术、印模制取、临时冠试戴、预定个性化基台、终修复完成等涉及基台的断开、连接的操作均可在连接之前涂覆该抗菌涂层，增强其抗菌性能。