谢 姗,徐兴欣

糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病最常见的微血管并发症，在DN发生和发展中巨噬细胞的参与起着至关重要的作用。研究显示，在DN肾组织中，过表达的Krüppel样因子4(Krüppel-like factor4,KLF4)可以抑制肾脏炎症，表现出抗炎、抗纤维化的保护作用[1-3]，也可以在巨噬细胞炎症中进行调节[4-5]。因而，激活KLF4的表达可能是延缓DN进展的有效手段。汉黄芩苷(wogonoside, WG)属于生物活性黄酮，具有抗氧化、抗炎、抗病毒和抗癌的作用[6]。同时，WG能显著降低脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激引起的巨噬细胞炎症因子释放[7]。但是WG是否干预高糖诱导巨噬细胞活化，KLF4是否参与炎症及WG干预机制，目前尚未见报道。该研究以巨噬细胞为研究对象，通过观察WG对巨噬细胞中相关信号通路及炎症因子的影响，探讨 KLF4-蛋白核因子κB(nuclear factor κB, NF-κB)信号通路在高糖诱导巨噬细胞激活中的具体机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂小鼠巨噬细胞系(RAW264.7)购自中科院上海细胞生物学研究所。WG(Batch NO.:DST210409-026)购自成都乐天美医药科技有限公司。兔抗CD68、白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、诱生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)、KLF4单克隆抗体购自美国Abcam公司，NF-κB p65、NF-κB pp65单克隆抗体购自美国CST公司，小鼠抗β-actin单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG、羊抗小鼠IgG抗体购自武汉三鹰公司，小鼠TNF-α、IL-1β ELISA试剂盒购自美国R&D公司, DMEM低糖培养基、胎牛血清购自加拿大Wisent公司，D-葡萄糖、2-脱氧-D-葡萄糖(2-deoxy-D-glucose,2-DG)购自美国Sigma公司，BCA蛋白测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶试剂盒购自江苏碧云天公司，TRIzol试剂购自雅酶公司，反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒购自艾科瑞生物公司，ECL化学发光试剂盒购自美国Thermo Scientific公司。PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 将RAW264.7细胞培养于含10%胎牛血清的低糖5.5 mmol/L DMEM培养基，放置于条件为37 ℃、5%CO2的培养箱。将细胞随机分为：LG组(5.5 mmol/L葡萄糖培养基)、D组(30 mmol/L甘露醇培养基)、HG组(30 mmol/L葡萄糖培养基)、LG+WG50组(5.5 mmol/L葡萄糖+50 μmol/L WG)、HG+WG12.5组(30 mmol/L葡萄糖+12.5 μmol/L WG)、HG+WG25组(30 mmol/L葡萄糖+25 μmol/L WG)、HG+WG50组(30 mmol/L葡萄糖+50 μmol/L WG)后同步化培养24 h，高糖刺激在WG预处理2 h后加入培养基，光镜观察各组细胞数量及形态变化，检查各组指标变化，并收集数据。

1.2.2细胞活力测定 将RAW264.7细胞置于96孔板中，于低糖培养条件下同步化24 h后，分别更换0、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L WG高糖培养基，24 h后加入CCK-8孵育2 h，酶标仪450 nm波长下进行光密度(optical density，OD)值测定，并使用公式OD(450)实验组/OD(450)0 μmol/L×100%算出细胞活力。

1.2.3细胞荧光检测 将RAW264.7细胞以1×105个/孔的密度接种在玻璃皿底，4%多聚甲醛固定10 min，10%牛血清蛋白阻断30 min，加入iNOS一抗溶液4 ℃孵育过夜。PBS洗涤3次后，加入FITC标记的荧光二抗室温避光孵育1 h，DAPI染核5 min，加荧光抗淬灭剂封片后，在荧光显微镜下观察并采集图象，各组随机选取5～10个高倍镜视野，使用Image J软件计数细胞平均数。

1.2.4Western blot分析 收集各组细胞，加RIPA裂解液冰上裂解，BCA试剂盒测定蛋白浓度并计算上样量。适量蛋白通过SDS-PAGE凝胶进行电泳后转移到NC膜，用5%的脱脂牛奶封闭2 h，再用稀释一抗NF-κB p65(1 ∶1 000)、NF-κB pp65(1 ∶1 000)、KLF4(1 ∶1 000)、iNOS(1 ∶1 000)、TNF-α(1 ∶1 000)、IL-1β(1 ∶1 000)4 ℃孵育12 h，用HRP标记的山羊抗鼠或抗兔二抗(1 ∶8 000)进行孵育，TBST洗3次，滴加ECL显色剂在凝胶成像系统进行化学发光，并用Image J进行半定量分析。

1.2.5qRT-PCR TRIzol试剂裂解细胞后提取总RNA，进行RNA浓度及纯度鉴定，使OD260/280在1.8～2.1之间，并在反转录系统中逆转录为cDNA。依据SYBGREEN PCR试剂盒进行定量分析，终体积10 μl。引物序列见表1。每个样本设置3个复孔，设置GAPDH为内参对照进行校正，用2-△△Ct计算目的基因的相对表达量。

表1 引物序列

1.3 统计学处理所有数据使用SPSS 18.0软件进行统计学分析，方差齐性应用Levene法检验，两组间比较应用独立样本t检验，多组间比较应用单因素方差分析(One-way ANOVA)，方差不齐应用K-W检验或Wilcoxon秩和检验，LSD分析数据以确定显著差异性。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 WG对RAW264.7细胞活性的影响WG选取0～100 μmol/L范围中6个浓度，见图1，当WG浓度在0～50 μmol/L时，高糖刺激后的RAW264.7细胞活性无明显影响(P>0.05)，WG浓度高于50 μmol/L时，细胞活性明显下降(P<0.01)。

图1 CCK-8法检测WG对RAW264.7细胞活性的影响与0 μmol/L WG比较：**P<0.01

2.2 高糖刺激各组巨噬细胞iNOS的表达高糖刺激的巨噬细胞中iNOS表达量增高，阳性细胞数明显高于低糖培养的巨噬细胞(P<0.01)，表明高糖可以促进巨噬细胞炎症。加入50 μmol/L WG预处理的高糖巨噬细胞，iNOS表达的阳性细胞数明显低于HG组，差异有统计学意义(P<0.01)，见图2。

图2 LG组、HG组与HG+W50组iNOS的表达 ×400A:LG组；B：HG组；C：HG+W50组；D：荧光镜下iNOS阳性面积统计；与LG组比较：**P<0.01;与HG组比较：##P<0.01

2.3 WG减轻高糖刺激RAW264.7细胞引起的炎症Western blot、qRT-PCR结果显示，WG预处理2 h后，高糖刺激的RAW264.7细胞iNOS、TNF-α、IL-1β、NF-κB pp65表达均明显增高(P<0.01)，WG明显抑制iNOS、TNF-α、IL-1β、NF-κB pp65表达，且50 μmol/L的抑制程度最明显，与HG组对比，差异有统计学意义(P<0.01)，见图3～5。ELISA法检测各组细胞上清液，结果表明高糖刺激上清液中TNF-α、IL-1β表达增高，不同浓度的WG作用后TNF-α、IL-1β呈浓度依赖性降低(P<0.01)，见图6。

图3 Western blot检测各组细胞中NF-κB p65、NF-κB pp65、KLF4、iNOS、TNF-α及IL-1β蛋白表达A:LG组、HG组、D组、LG+W50组的Western blot实验条带图；B：NF-κB p65、NF-κB pp65、KLF4、iNOS、TNF-α及IL-1β蛋白表达半定量统计；与LG组比较：**P<0.01；与HG组比较：##P<0.01

图4 Western blot检测各组细胞中NF-κB p65、NF-κB pp65、KLF4、iNOS、TNF-α及IL-1β蛋白表达A:LG组、HG组、HG+W12.5组、HG+W25组和HG+W50组的Western blot实验条带图；B：NF-κB p65、NF-κB pp65、KLF4、iNOS、TNF-α及IL-1β蛋白表达半定量统计；与LG组比较：**P<0.01；与HG组比较：#P<0.05，##P<0.01

图5 qRT-PCR检测各组细胞中KLF4、iNOS、TNF-α及IL-1β mRNA表达A: KLF4 mRNA表达；B iNOS mRNA表达；C:TNF-α mRNA表达；D: IL-1β mRNA表达；a:LG组；b:HG组；c:D组；d：LG+W50组；e:HG+W12.5组；f：HG+W25组；g：HG+W50组;与LG组比较：**P<0.01；与HG组比较：#P<0.05，##P<0.01

图6 各组细胞上清液中炎症因子TNF-α及IL-1β水平变化A：TNF-α表达水平；B：IL-1β表达水平；a:LG组；b:HG组；c:D组；d：LG+W50组；e:HG+W12.5组；f：HG+W25组；g：HG+W50组;与LG组比较：**P<0.01；与HG组比较：##P<0.01

2.4 WG干预高糖刺激RAW264.7细胞中KLF4的表达Western blot结果显示，高糖刺激后，巨噬细胞内KLF4蛋白表达量较LG组下降(P<0.01)，在WG干预后，KLF4的蛋白表达量呈现增高现象(P<0.01),见图3、4。通过qRT-PCR再次观察了KLF4 mRNA表达量变化，结果同样显示巨噬细胞内KLF4 mRNA表达量较LG组下降(P<0.01)，在WG干预后，KLF4 mRNA的表达量呈现剂量依耐性增高现象(P<0.01),见图5A。

3 讨论

DN已经成为终末期肾脏病的主要原因之一，且在中国人群中的患病率逐年上升[8]。众所周知，自身免疫病发展与巨噬细胞的长期激活有关，持续不断分泌的炎症因子，最终对正常组织及细胞造成无法修复的损害，导致肾组织纤维化及肾脏功能下降[9]。本实验以高糖刺激的巨噬细胞为研究对象，模拟糖尿病高糖环境，探究WG抑制DN炎症发展的可能机制。

在长期高血糖状态下，巨噬细胞在肾组织中异常聚集，激活TLR4、NF-κB等通路，分泌大量TNF-α、IL-1β炎症因子，导致肾小球、肾小管及基底膜病理性改变，进而出现蛋白尿增多等临床症状。TNF-α和IL-1β被称作巨噬细胞炎症的“警报细胞因子”，它们会进一步诱导促炎基因iNOS的产生。此次研究中采用高糖刺激小鼠RAW264.7巨噬细胞，观察炎症信号蛋白及相关炎症因子表达。结果表明，高糖刺激后，NF-κB p65、NF-κB pp65、iNOS表达增高,促炎因子TNF-α、IL-1β表达明显上调，巨噬细胞极化。与Zhu et al[9]及汤祥瑞 等[10]研究结果相似，高糖可以直接或间接的刺激巨噬细胞迁移、炎症因子的分泌及iNOS表达增加。

巨噬细胞是先天免疫的重要参与者，而KLF4是巨噬细胞生物学中的关键介质，起着调节巨噬细胞促炎效应。本研究显示，KLF4在高糖诱导的RAW264.7细胞中表达下调，并且伴随炎症因子的释放及iNOS的增加。与多数研究[11-12]结果一致，KLF4在肾脏保护及炎症抑制方面有极大地探索意义。有研究[2-3, 13]报道KLF4抑制STAT3、mTOR和NF-κB p65的激活，以改善动脉粥样硬化及脓毒血症等疾病的进展。此研究验证出高糖刺激巨噬细胞24 h出现抑制KLF4表达的情况，说明在炎症状态中KLF4是处于低表达状态。也有文献[3]报道在炎症激活过程中，NF-κB p65活性增强抑制KLF4的转录作用，KLF4表达下调会激活NF-κB pp65的表达，两者形成正反馈效应加快炎症反应的进行。由此推测KLF4介导是DN炎症发展过程的重要环节。

WG是一种低毒、低成本、高疗效的黄酮类天然化合物[8]，具有抗炎、抗氧化、抗癌等作用。多数研究证明，WG有显著的抗炎活性，可以明显减轻结肠炎[6]、脂肪肝[14]及慢性咽炎[15]等疾病进展，但在DN介导的慢性炎症中的作用及机制还有待探索。在本研究中，通过CCK-8实验验证高糖条件下细胞安全浓度范围，再用不同浓度的WG给予细胞预处理，然后再用高糖刺激巨噬细胞活化。结果表明，WG减轻HG组巨噬细胞TNF-α、IL-1β的分泌和iNOS的表达，这种作用是通过抑制NF-κB p65的磷酸化，逆转巨噬细胞抗炎活性，成功减轻了高糖诱导的巨噬细胞炎症。此外，KLF4表达量在WG作用下呈剂量依赖性递增，提示KLF4不仅是炎症中的重要参与者，更在DN中发挥保护性作用，并参与到WG的治疗机制中。

综上所述，本研究表明高糖刺激巨噬细胞后，其KLF4表达减少，而WG可以刺激巨噬细胞KLF4的表达增高，进而抑制高糖刺激巨噬细胞产生促炎因子和炎性物质，其机制是由于KLF4表达增高抑制了NF-κB p65的磷酸化，进而减少了iNOS的表达。提示KLF4/NF-κB相关信号通路可能参与到WG影响巨噬细胞改善DN的过程。由于本研究缺乏对相关靶向蛋白干预和相应体内模型验证，将在以后的研究中加以探讨，以期为DN的治疗提供新的思路。