王 帆，杨 梅，陈章铭，杨 桦*，杨 伟，黄 琼

（1.四川农业大学林学院/四川省林业生态工程省级重点实验室，成都 611130；2.四川省南江县林业局，四川 南江 635600）

长足大竹象Cyrtotrachelus buquetiGuerin-Meneville，又名竹横锥大象，是我国丛生竹的主要钻蛀性害虫[1]，主要分布于我国长江以南的地区以及越南、缅甸、泰国等东南亚国家[2-3]。长足大竹象寄主广泛，以幼虫蛀食危害箣竹属Bambusa、绿竹属Dendrocalamopsis、牡竹属Dendrocalamus等28 个竹种的竹笋，幼虫生长速度快、危害性极强、隐蔽性高以至于防治困难[4]。近年来，由于国家实施天然林保护工程，大力发展经济林，禁止砍伐树木，以竹代木已经成为造纸原料发展的趋势。在四川长足大竹象是制约竹林经济发展的主要因素之一[5]。而王嘉雯等[6]利用Matlab分析了长足大竹象的发生规律以及全球气候变暖条件下适生区的变化，进一步阐述了对其防治的重要性。

昆虫生长调节剂(insect growth regulators,IGR’s)是一类以破坏昆虫正常生长发育或生殖作用，达到控制害虫发生的仿生合成杀虫剂[7]。此类药剂因其毒性低、污染少和对害虫的天敌影响小，符合害虫综合治理及农林业持续发展的要求。目前根据其不同的作用方式以及化学结构分为保幼激素类似物、几丁质合成抑制剂和蜕皮激素类似物3个大类[8]。现已广泛用于防治农林、卫生和畜牧业害虫，如韭菜迟眼蕈蚊Bradysia odoriphaga、杜鹃冠网蝽Stephanitis pyrioides和麦蛾茧蜂Habrobracon hebetor等[7,9-13]。但是，目前昆虫生长调节剂在防治蛀干害虫方面的研究很少，因此，本试验测定了昆虫生长调节剂中的几丁质合成抑制剂氟铃脲，保幼激素类似物吡丙醚与昆虫蜕皮激素类似物甲氧虫酰肼对长足大竹象两个龄期幼虫的毒力、温度效应和相关酶活性测定，旨在为长足大竹象的治理和丛生竹安全生产提供理论和技术支持。

1 材料和方法

1.1 供试虫源

在2018年8月上旬长足大竹象Cyrtotrachelus buquetiGuerin-Meneville成虫产卵期，于四川省芦山县思延乡铜头村(102°91′E，30°13′N)慈竹林采集虫卵。带回实验室，在培养皿(Φ=10 cm)中进行人工孵化，初孵幼虫转置筒形牙签盒内(Φ=5 cm;H=10 cm)，以新鲜慈竹笋为饲料单头饲养。人工气候箱温度为(28±1)℃、相对湿度(70±10)%，黑暗饲养。

1.2 供试药剂

97.5%氟铃脲(hexaflumuron)原药、95.3%吡丙醚(pyriproxyfen)原药、98.6%甲氧虫酰肼(methoxyfenozide)原药（均购自武汉远成共创科技有限公司，中国武汉）；99.5%丙酮分析纯（成都市科龙化工试剂厂，中国成都）；考马斯亮蓝G-250，磷酸缓冲液PB，以及过氧化物酶(POD)，超氧化物歧化酶(SOD)，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，乙酰胆碱酯酶(AchE)靶标酶和羧酸酯酶(CarE)试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，中国北京）。

1.3 药剂对长足大竹象幼虫的毒力测定

采用饲喂法，分别测定氟铃脲、吡丙醚和甲氧虫酰肼对长足大竹象2龄和4龄幼虫的毒力(长足大竹象幼虫共5个龄期，2龄为低龄组，4龄为高龄组)。每种供试药剂均用丙酮溶液稀释成5个浓度(低龄组：2.5、5、10、20和40 mg/L；高龄组：10、20、40、80和160 mg/L)，分别以丙酮溶液和蒸馏水作为对照，每个浓度重复3次。每处理浓度挑取2龄和4龄幼虫各20头，分别放入筒形牙签盒内(Φ=5 cm;H=10 cm)。将配好的药液浸渍慈竹笋Neosinocalamus affinis10 min，自然晾干后放入盒内作为饲料，并放入人工气候箱中，温度(28±1)℃、相对湿度(70±10)%，黑暗饲养。处理后1～7 d，每天统计幼虫存活数，并计算各药剂的毒力回归方程及LC50。

1.4 药剂对4龄幼虫毒力的温度效应测定

采用饲喂法，将药剂原药稀释成系列浓度，处理方法同1.3。处理后分别置于温度为(22±1)、(24±1)、(26±1)、(28±1)、(30±1)和(32±1)℃，相对湿度(70±10)%的人工气候箱中，黑暗饲养。每个温度对应5种浓度，每处理分别挑取4龄幼虫20头，重复3次，以丙酮溶液和蒸馏水作为对照。每天更换浸渍药液的慈竹笋，记录7 d后幼虫存活数，并计算各药剂在不同温度下的毒力回归方程及LC50。

1.5 酶液制备

采用饲喂法，挑选出大小一致的4龄幼虫，用3种昆虫生长调LC50的浓度浸泡的慈竹笋10 min后进行饲喂，蒸馏水为对照，饲养方法同1.3。参照高欢欢等[14]和武海斌等[15]的酶液提取法，分别处理1、2、3、4和5 d后，收集每个处理存活的虫体称重后置于6 cm研钵中，加入1 mL PB(0.05 mol/L，pH 7.0)和少量石英砂，冰浴充分研磨，混匀，在超速冷冻离心机8 000 r/min 4℃离心10 min。取上清液分装入0.5 mL的Eppendorf离心管中，-80℃保存备用，用于POD、SOD和GSTs活性测定，每处理重复3次。

参照任学祥等[16]的AchE酶液和徐伟等[17]的CarE酶液提取方法，分别于处理1、2、3、4和5 d后，收集每个处理存活的虫体称重后置于6 cm研钵中，加入1 mL PB(0.05 mol/L，pH 7.0)和少量石英砂，冰浴充分研磨，混匀，在超速冷冻离心机15 000 r/min 4℃离心10 min，取上清液作为酶液，每处理重复3次。

1.6 酶活性测定

POD、SOD、GSTs、AchE和CarE酶活性的测定均严格按照试剂盒中的说明进行检测。酶活性值根据试剂盒说明书中的公式进行计算。POD、SOD、GSTs、AchE和CarE酶活性测定波长分别为470、560、340、412和450 nm。POD活性单位定义为每克组织蛋白在每1 mL反应体系中每分钟470 nm吸光值变化0.01为一个酶活力单位；SOD活性单位定义为每克组织蛋白在1 mL反应液中抑制率为50%时所需的酶量为一个酶活力单位；GSTs活性单位定义为在25℃下，每克样品每分钟催化1 μmol还原性谷胱甘肽与2,4-二硝基苯结合为一个酶活性单位；AchE活性单位定义为每克组织蛋白每分钟催化产生1 μmol 5-巯基硝基苯甲酸的酶量为一个酶活力单位；CarE活性单位定义为在37℃下，每1mL反应体系中每克组织鲜重每分钟催化吸光值增加1定义为一个酶活力单位。

蛋白质质量浓度用考马斯亮蓝(G-250)法进行测定[18]。

1.7 数据分析

采用SPSS 19.0软件计算毒力回归方程及LC50值，GraphPad Prism 6进行制图。对POD、SOD、GSTs、AchE和CarE活性采用单因素方差分析，处理与对照间采用配对t检验。

2 结果与分析

2.1 昆虫生长调节剂对两个龄期幼虫的毒力

3种昆虫生长调节剂对长足大竹象2龄幼虫的毒力大小为甲氧虫酰肼＞氟铃脲＞吡丙醚，而对4龄幼虫的毒力为吡丙醚＞甲氧虫酰肼＞氟铃脲。2龄幼虫处理24 h，甲氧虫酰肼LC50为28.13 mg/L。4龄幼虫处理中，吡丙醚LC50为111.55 mg/L。3种供试药剂对2龄幼虫的毒力均大于对4龄幼虫的毒力，即2龄幼虫对药剂更敏感。其中，氟铃脲对2龄和4龄幼虫的毒力差异达到11.95倍，幼虫龄期对药剂毒性效果的影响最大(表1)。

表1 3种昆虫生长调节剂对长足大竹象不同龄期幼虫的毒力比较Table 1 Toxicity of five kinds of IGRs to different instars of Cyrtotrachelus buqueti

2.2 3种药剂对4龄幼虫致毒的温度效应

氟铃脲在22℃时对长足大竹象4龄幼虫的LC50最大，为755.80 mg/L，而28℃最小，为294.11 mg/L；吡丙醚也在28℃时LC50最小，71.51 mg/L，32℃时LC50最大，175.68 mg/L；根据实验温度的不同，甲氧虫酰肼的LC50变化差异不明显(表2)。

表2 不同温度下3种昆虫生长调节剂对长足大竹象4龄幼虫的毒力比较Table 2 Toxicity of three insecticides to the 4thinstar larvae of C.buqueti at different temperature

2.3 3种药剂对4龄幼虫体内抗氧化酶的影响

2.3.1 POD活性

由图1可知，经甲氧虫酰肼处理后的POD活性只在第5天显著高于对照(P＜0.05)；在不处理间比较中，第5天的POD活性显著高于其余4个时间段(P＜0.05)。

图1 3种生长调节剂亚致死剂量下长足大竹象4龄幼虫体内POD的活力变化Figure 1 Dynamics of POD activities in 4thinster larvae of C.buqueti treated with sublethal doses of three insect growth regulators

经氟铃脲处理后的POD活性只在第4天的显著低于对照(P＜0.05)；在不同处理间比较中，第1天和第2天的POD活性显著高于其余3个时段(P＜0.05)。

吡丙醚处理后的POD活性都显著高于对照(P＜0.05)；在不同处理间比较中，第5天的POD活性显著高于其余4个时段(P＜0.05)

2.3.2 SOD活性

3种生长调节剂亚致死浓度在对4龄幼虫的SOD活性影响中(图2)，经甲氧虫酰肼、氟铃脲和吡丙醚处理后的SOD活性均只在第5天显著低于对照(P＜0.05)。而在不同处理间比较中，甲氧虫酰肼、氟铃脲和吡丙醚均是第1天的SOD活性显最高。甲氧虫酰肼和氟铃脲第1天、第2天差异不显著(P＞0.05)。

图2 3种生长调节剂亚致死剂量下长足大竹象4龄幼虫体内SOD的活力变化Figure 2 Dynamics of SOD activities in 4thinster larvae of C.buqueti treated with sublethal doses of three insect growth regulators

2.4 3种药剂对4龄幼虫体内解毒酶活性的影响

2.4.1 AchE活性

由图3可知，经甲氧虫酰肼、和氟铃脲处理后的AchE活性均显著高于对照(P＜0.05)。在不处理间比较中，甲氧虫酰肼是第1天的AchE活性显著高于其余4个时间段(P＜0.05)，而氟铃脲在不同处理间比较中差异不显著(P＞0.05)。

图3 3种生长调节剂亚致死剂量下长足大竹象4龄幼虫体内AchE的活力变化Figure 3 Dynamics of AchE activities in 4thinster larvae of C.buqueti treated with sublethal doses of three insect growth regulators

吡丙醚处理后的AchE活性只在第3天显著低于对照(P＜0.05)；在不同处理间比较中，第5天的AchE活性显著高于其余4个时段(P＜0.05)。

2.4.2 CarE活性

由图4可知，经甲氧虫酰肼和氟铃脲处理后的CarE活性均显著低于对照(P＜0.05)。在不同处理间比较中，甲氧虫酰肼是第1天的CarE活性显著高于其余4个时间段(P＜0.05)，而氟铃脲是第4天的CarE活性显著高于其余4个时间段(P＜0.05)。

图4 3种生长调节剂亚致死剂量下长足大竹象4龄幼虫体内CarE的活力变化Figure 4 Dynamics of CarE activities in 4thinster larvae of C.buqueti treated with sublethal doses of three insect growth regulators

吡丙醚处理后的CarE活性在第3天和第4天显著高于对照(P＜0.05)；在不同处理间比较中，第4天和第5天的CarE活性显著高于其余3个时段(P＜0.05)。

2.4.3 GSTs活性

由图5可知，经甲氧虫酰肼处理后的GSTs活性都显著高于对照(P＜0.05)；在不处理间比较中，第5天的GSTs活性最高，但与第4天差异不显著(P＞0.05)。

图5 3种生长调节剂亚致死剂量下长足大竹象4龄幼虫体内GSTs的活力变化Figure 5 Dynamics of GSTs activities in 4thinster larvae of C.buqueti treated with sublethal doses of three insect growth regulators

经氟铃脲处理后的GSTs活性在第3天和第4天的显著低于对照(P＜0.05)；在不同处理间比较中，第1天和第5天的GSTs活性显著高于其余3个时段(P＜0.05)。

经吡丙醚处理后的GSTs活性都显著高于对照(P＜0.05)；但在不处理间比较中差异不显(P＞0.05)。

3 讨论

本实验发现3种昆虫生长调节剂对长足大竹象2龄幼虫的毒力都较高，最高的是蜕皮激素类似物甲氧虫酰肼，毒力倍数为保幼激素类似物吡丙醚的2.25倍。而甲氧虫酰肼以其独特的作用机制，良好的防治效果，已成为替代有机磷和拟除虫聚酯类杀虫剂，防治蔬菜以及其他农作物、林业上多种害虫的理想药剂[19-21]。但是3种药处理2龄幼虫得到的半致死浓度均小于处理4龄幼虫的半致死浓度，氟铃脲和处理2、4龄幼虫半致死浓度相差最大，为11.95倍，表明幼虫龄期对毒力的影响较大。

杀虫剂对受体的毒力，不仅取决于药剂本身与受体之间内在的特殊关系，还与环境条件等因素密切相关，其中温度是重要的因子之一[22]。本实验发现，长足大竹象4龄幼虫对氟铃脲和吡丙醚的敏感度受温度的影响程度较大，并在28℃时的敏感度达到了最大值，而对甲氧虫酰肼的敏感度受温度变化的影响较小。

在药物的作用下，昆虫体内会产生一类可代谢药剂与其他有毒物质的酶[23]。昆虫对药物抗性的作用机制之一是相关的酶活力显著升高，或某些酶活性降低，使其解毒代谢能力增强而对杀虫剂形成抗性[24-25]，而涉及代谢抗性的保护、解毒酶主要包括乙酰胆碱酯酶(AChE)靶标酶、谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)、羧酸酯酶(CarE)和过氧化物酶(POD)等[25]。实验结果表明，在LC50浓度下氟铃脲对长足大竹象4龄幼虫体内GST活性是激活-抑制-激活的趋势，对AChE活性，从处理的第1天到第5天，一直处于激活状态，但对CarE活性则是抑制；甲氧虫酰肼对体内幼虫GST和AChE活性的影响表现出激活的状态，但对CarE则是表现出抑制效果；吡丙醚对体内GSTs是激活的状态，对AchE则是先激活，在处理3 d时为转折再抑制，再激活的状态，而对CarE活性表现为抑制-激活-抑制的趋势。说明保护、解毒酶在长足大竹象幼虫体内是一种不断变化的过程。吕林兰等[26]研究马拉硫磷对双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis体内解毒酶和保护酶的影响，发现沙蚕在低浓度下暴露3 d和6 d时，体内AchE活性受到显著性抑制，体内CAT活性随处理浓度的增加呈现出先下降后上升的趋势。康敬涛和高希武[27]研究了杀虫剂对豆蚜Aphis craccivora解毒酶的影响，结构显示吡虫啉、溴氰菊酯无显著抑制作用，氧乐果和辛硫磷处理组的解毒酶活性显著降低。汤芳等[28]研究发现用低浓度2-十三烷酮处理杨小舟蛾Micromelalopha troglodyta时，其GST活性显著降低，但随着处理浓度增高，体内GST活性也有所增高。

刘丽华等[29]研究发现，北乌头乙醇提取物对菜青虫Pieris rapaeSOD活性的影响是先激活后抑制，并在处理后24 h活性达到最大值，体内POD表现为先抑制后激活的现象。任晓亚等[30]发现嗜菌异小杆线虫涿州品系Heterorhabditissp.处理光肩星天牛Anoplophora glabripennis幼虫后，其体内SOD和POD随处理时间的增加表现出先升后降的现象；同时，体内过氧化氢酶(CAT)却呈现出被激活、抑制、再激活和再抑制的现象，并推测这是被侵染后，体内保护酶协同作用的表现。本实验显示，甲氧虫酰肼和氟铃脲对长足大竹象幼虫体内SOD活性主要表现先激活后抑制作用，而经吡丙醚处理后SOD活性主要表现为激活，且体内SOD活性随处理时间延长逐渐减小。对于体内POD活性，氟铃脲主要表现为抑制；而甲氧虫酰肼对体内POD活性是先抑制后激活；吡丙醚主要是表现为激活。

昆虫体内的保护酶(POD和SOD)相互协调，参与细胞内自由基的产生与清除，其中SOD的功能是催化超氧阴离子自由基(O2-)歧化生成过氧化氢(H2O2)，POD具有分解H2O2的能力[31]。本实验中，3种生成调节剂处理后，只有甲氧虫酰肼的POD整体低于对照，推测长足大竹象4龄幼虫体内很难被诱导产生更多的POD分解甲氧虫酰肼产生的H2O2。昆虫解毒酶系(AChE、CarE、GSTs)对农药的代谢起重要作用，解读能力增强是昆虫对农药产生抗性的主要原因之一[32]。而经氟铃脲处理的CarE和GSTs显著低于对照，推测长足大竹象4龄幼虫对氟铃脲更敏感。

本实验中对长足大竹象幼虫体内保护酶和解毒酶活性的测定均是在短期胁迫下进行的，要明确某种酶是否参与了长足大竹象对3种生长调节剂的代谢还需要进一步的系统研究。