朱伟垚，林梦婷，吴仲义，许晓晨，赵文宝，宋 漳，张清华*

（1.福建农林大学林学院森林保护研究所，福州 350002；2.建阳区华家山毛竹采育场，福建 南平 354203）

内生细菌普遍存在于植物中，与寄主植物形成共生、互利、共栖和营养共生，直接或间接促进植物生长，提高植物对恶劣环境与病害的抵抗能力[1-7]。植物生长阶段的不同会影响其内生细菌的组成，某些内生细菌只会在植物特定生长阶段出现，并且随植物生长阶段的不同，其优势内生细菌也不同[8-13]。内生细菌群落组成会随植物生长阶段动态变化[14]，并且与宿主基因型相比，植物生长阶段对内生细菌的影响更加显著。

竹子是一种高生态价值和高经济价值的植物，我国竹林面积有601万hm2，其中毛竹林面积最大。毛竹（Phyllostachys heterocycla）为禾本科（Gramineae）竹亚科（Bambusoideae）刚竹属（Phyllostachys）植物，毛竹生长迅速，1～2 a完成增粗长高过程，之后便着重细胞木质化和细胞壁加厚方向，5 a后结束幼林期[15-17]，在毛竹幼林期（1～5 a）中，毛竹对营养物质的吸收和积累并不是逐年递增，而是在特定的年份集中吸收和积累某种营养元素[18]，而在毛竹细胞内木质素及其相关物质则与竹龄呈线性相关[19]。

有关毛竹的研究主要集中在毛竹病害及其预防和治理[20-21]、土壤理化性质[22]和不同毛竹林结构特征及其毛竹林植物多样性以及毛竹根际可培养微生物种群多样性[23-25]等方面，对于不同竹龄的毛竹内生细菌多样性研究鲜有报道，研究不同竹龄内生细菌的种群结构及功能变化，对于探究毛竹与其共生菌的相互作用，毛竹的高效培育将有重要意义。随着高通量测序的技术发展，该技术在植物内生细菌的研究中应用广泛，高通量测序不需要将植物内生细菌分离培养，可以直接从DNA层面对研究材料中的内生细菌进行种群组成分析，相对传统研究方法可以更加完整、准确地展现植物内生细菌的多样性信息，弥补了由于大部分植物内生细菌不能体外培养而导致的多样性评价不完全的缺陷[26]。本次研究以不同竹龄的福建毛竹茎干组织为材料，通过Illumina NovaSeq进行内生细菌多样性测序，分析各样本物种组成、群落结构及多样性和内生细菌功能，揭示毛竹茎干内生细菌生物信息和随时间群落演替情况，为植物内生细菌生态功能及与植物互作机制研究提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

采样地点福建省南平市华家山林场（N27°12′0.02，E117°50′21.41），采样时间为2021年4月，选取同一片地点，生长状态良好的1～5 a生毛竹（S1、S2、S3、S4、S5），取距离地面1m处茎干组织片，表面用75%的酒精擦拭干净，用消毒电锯割下月5 cm×10 cm的竹片，放入冰盒中，带回实验室进一步消毒处理。每个年龄段取3棵竹子分别采样。

1.2 材料处理

样品表面消毒：样本使用无菌水冲洗3 min，75%医用酒精浸泡30 s，无菌水浸泡清洗3次，2%次氯酸钠溶液浸泡3 min，最后使用无菌水清洗4次。使用天根高效植物基因组DNA提取试剂盒提取DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。将同一竹龄的3个样本DNA混合成一管，最终5个竹龄共5个样本（S1、S2、S3、S4、S5）送去上海派森诺生物科技有限公司进行测序。

1.3 高通量测序与数据处理

上海派森诺生物科技有限公司提供高通量测序服务，采用Illumina NovaSeq平台对样本DNA片段进行双端（Paired-end）测序，测序引物为正向：AACMGGATTAGATACCCKG反向：ACGTCATCCCC ACCTTCC，测序区域为16S rRNA V3～V4区域。使用QIIME2（2019.4）平台DADA2方法进行序列处理。调用qiime cutadapt trim-paired切除序列的引物片段，弃去未匹配引物的序列；然后通过qiime dada2 denoise-paired调用DADA2进行质控、去噪、拼接和去嵌合体。得到ASVs（amplicon sequence variants）。基于细菌数据库silva 132采用QIIME2的classify-sklearn算法进行物种分类学注释。

1.4 Alpha多样性分析

Alpha多样性是指局部均匀生境下的物种在丰富度（richness）、多样性（diversity）和均匀度（evenness）等方面的指标，也被称为生境内多样性(within-habitat diversity)[27]。Chao1代表ASV数目，Observed species代表物种指数，Chao1和Observed species指数代表群落的丰富度，值越大，丰富度越高[28]。Simpson描述从一个群落种连续两次抽样所得到的个体数属于同一种的概率。Shannon来源于信息熵，香农指数越大，表示不确定性大，Shannon和Simpson指数群落的多样性，Shannon指数值越大，群落多样性越高，Simpson指数范围0～1，越接近1表示多样性越高[29-30]。Faith′s PD指数表示群落的遗传多样性，值越大，遗传多样性越高[31]。

1.5 距离矩阵与PcoA分析及层次聚类

根据抽平后的ASV表计算Bray-Curtis距离矩阵，并对这些距离矩阵做主坐标分析(principal coordinates analysis，PCoA)分析，对bray-curtis距离矩阵采用UPGMA算法（即聚类方法为average）进行聚类分析。

1.6 功能潜能预测

基于KEGG数据库(https://www.kegg.jp/)使用PICRUSt2进行功能潜能分析。将各样本测序得到的16S rRNA基因序列构建进化树，使用Castor隐藏状态预测算法，依据进化树中参考序列所对应的基因家族拷贝数，推测特征序列的最近序列物种，进而获得其基因家族拷贝数。结合各样本特征序列的丰度，计算各样本的基因家族拷贝数。最后，将基因家族“映射”到KEGG数据库中，默认使MinPath推断代谢通路的存在，进而获得各样本中代谢通路的丰度数据。

2 结果与分析

2.1 序列数据处理与评价

对所有样本有效序列进行拼接，去除嵌合体和singleton后的序列量为473 959，不同竹龄的样品最终的序列reads数量分别是108 663、99 655、86 821、93 434和85 386。序列长度分布为322～384 bp，大多数分布在378 bp中。使用DADV2进行序列处理，不以序列相似度聚类，只进行去重（相当于以100%序列相似度聚类），生成ASV单元。5个样本共得到5 524个ASVs。1～5 a生毛竹茎干的ASV数量分别是127、800、1 522、1 513和 1 562，3～5 a生（S5）之间的毛竹茎干样本ASVs数量比其他样本明显增多，并且2 a生毛竹与1 a生毛竹茎干样本ASV数量差异显著（P=0.001）。

Chao1、Faith′s PD、Observed species、Shannon和Simpson的稀疏曲线（图1A-E）表明，随着测序深度的增加即抽样数的增加，Chao1、Faith′s PD、Observed species、Shannon和Simpson指数已经平缓，说明更多的测序量并不会对群落丰富度、多样性、遗传多样性和均匀度有影响，所以基于现有测序数据得到的分析结果准确可靠。

图1 稀疏曲线Figure 1 Rarefaction curves

2.2 群落物种组成分析

2.2.1 不同竹龄毛竹内生细菌群落物种数量

不同竹龄的毛竹茎干内生细菌群落物种数量不同，1 a生的毛竹（S1）茎干中各分类地位的细菌群落物种数量均少于其他竹龄的毛竹（表1）。从门到属之间，1 a生毛竹茎干中所含种类数量最少，只有4门6纲12目23科33属，4 a生毛竹茎干所含种类最多，有19个门30纲70目102科194属，3～5 a生之间在科及以上分类单元上数量差异不明显（表1）。

表1 不同竹龄毛竹茎干内生细菌分类单元群落组成Table 1 Community composition of endophytic bacterial taxa in the stems of Phyllostachys edulis at different ages

2.2.2 不同竹龄毛竹内生细菌群落组成及优势种群

所有样本内生细菌共包含21个门，在各个竹龄毛竹茎干内生细菌中，变形菌门（Proteobacteria）均为其优势门（图2A）。在各样本中所占相对丰度为76.93%、73.73%、59.77%和53.35%。厚壁菌门（Firmicutes）在样本中相对丰度仅次于变形菌门，分别为0.8%、14.58%、15.26%、28.73%和33.62%；

在纲水平上（图2B），所用样本共注释到41的纲，1 a生和5 a生样本相对丰度最高的纲为γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria），相对丰度分别为96.67%和43.21%。2～4 a生样本中相对丰度最高的纲均为α-变形菌纲（Alphaproteobacteria），相对丰度为59.42%、64.46%和50.16%。

在属水平上（图2C），所有样本一共注释到337个属，不同年竹龄毛竹茎干内生细菌群落组成与相对丰度有明显差异，1 a生毛竹（S1）茎干内生细菌鉴定到34个属，其中相对丰度最高是欧文氏菌属（Erwinia），相对分度78.18%，也是该样本中唯一的优势菌群，其他菌群相对分度均小于1.00%（图2 S1），2 a生毛竹（S2）茎干内生细菌鉴定到157个属，优势菌群是苍白杆菌属（Ochrobactrum）、链球菌属（Streptococcus）、根瘤菌科多个属（GenusofRhizobiaceae）、甲基杆菌属（Methylobacterium）和水小杆菌属（Aquabacterium），相对丰度别为22.49%、7.99%、5.72%、5.35%和5.09%。3 a生毛竹（S3）茎干内生细菌鉴定到222个属，优势菌群是苍白杆菌属（Ochrobactrum）和根瘤菌科多个属（GenusofRhizobiaceae），相对分度分别为30.97%和5.26%，除此之外，相对丰度＞1.00%的菌群有甲基杆菌属（Methylobacterium）、黄杆菌属（Flavobacterium）、链球菌属（Streptococcus）、梭菌属（Clostridium）、水小杆菌属（Aquabacterium）、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、德沃斯氏菌属（Devosia）和Pseudolabrys，相对丰度分别为 4.83%、2.03%、1.90%、1.86%、1.80%、1.80%、1.70% 和1.19%。4 a生毛竹（S4）茎干内生细菌鉴定到224个属，优势菌群是苍白杆菌属（Ochrobactrum）和梭菌属（Clostridium），相对丰度为22.30%和6.53%。除此之外相对丰度＞1.00%有根瘤菌科多个属（GenusofRhizobiaceae）、链球菌属（Streptococcus）、甲基杆菌属（Methylobacterium）、Terrisporobacter、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、德沃斯氏菌属（Devosia）、劳尔氏菌属（Ralstonia）和普氏菌属（Prevotella），相对丰度分别为 4.50%、4.37%、2.71%、1.85%、1.63%、1.36%、1.29%和1.21%。5 a生毛竹(S5)茎干内生细菌鉴定到195个属，优势菌群是欧文氏菌属（Erwinia）、梭菌属（Clostridium）和泛菌属（Pantoea），相对丰度分别为25.91%、14.59%和5.39%。除此之外相对丰度＞1.00%的有黄杆菌属（Flavobacterium）、假单胞菌属（Pseudomonas）、苍白杆菌属（Ochrobactrum）、Terrisporobacter、瘤胃球菌属（Ruminococcus）、密螺旋体属（Treponema）、乳杆菌属（Lactobacillus）、Christensenellaceae_R-7_group、链球菌属（Streptococcus）和Lachnospiraceae，相对丰度分别为 4.46%、4.32%、3.48%、2.65%、2.04%、1.89%、1.75%、1.67%、1.42%和1.15%。

图2 各样本内生细菌在门（A）、纲（B）和属（C）水平上的相对丰度Figure 2 Relative abundance of endophytic bacteria at phylum(A),class(B)and genus(C)levels in each sample

2.3 Alpha多样性指数

多样性指数分析（表2）显示，内生细菌群落丰富度（Chao1和Observed species）最高是5 a生毛竹（S5）茎干，群落丰富度最低为1 a生（S1）毛竹茎干。4 a生（S4）毛竹茎干内生细菌群落多样性最该，Shannon和Simpson指数分别为7.009和0.943，最低同样为内生细菌种类多样性，Simpson指数仅为0.415，未超过0.5。在群落遗传多样性（Faith′s PD指数）中最高是5 a生毛竹茎干，最低是1 a生毛竹茎干。在群落均匀度中最高的是4 a生毛竹茎干，最低的是1 a生毛竹茎干。在群落物种覆盖度（Good′s coverage指数）中最高的是1 a生毛竹茎干，最低的是4 a生。除群落物种覆盖度外，1 a生毛竹茎干在其他各方面均为最低。

表2 不同竹龄毛竹茎干内生细菌Alpha多样性指数分析Table 2 Analysis of Alpha diversity index of endophytic bacteria in Phyllostachys edulis stems of different ages

2.4 主成分分析与层次聚类

从PCoA分析图（图3A）可以得到主坐标分析1（PCoA1）和主坐标分析2（PCoA2）的样品差异性贡献率分别为66.9%和21.3%，合计为88.2%，是差异的主要来源。2 a生（S2）与3 a生（S3）毛竹茎干内生细菌群落多样性差异最小，其次二者与4 a生（S4）差异较小，1 a生（S1）和5 a生（S5）毛竹茎干内生细菌群落多样性差异较大，分别位于第二象限与第三象限。从层次聚类分析（图3B）中看到，其中2 a生（S2）和3 a生（S3）聚在一起，并且与4 a生（S4）比较接近，1 a生与5 a生与其他竹龄距离远。

图3 PcoA分析与层次聚类分析Figure 3 PcoA analysis and hierarchical clustering analysis

2.5 ASV venn图与共有物种分析

对所有样本ASV丰度情况进行venn图分析（图4A），结果表面5个竹龄毛竹茎干样本中共有的物种数量为24，各样本独有物种数量分别为67、479、1 065、992和1 196。共有物种基于属水平注释到16个属，样本总相对丰度＞1.00%分别为苍白杆菌属（Ochrobactrum）、根瘤菌科多个属（GenusofRhizobiaceae）、链球菌属（Streptococcus）、黄杆菌属（Flavobacterium）、甲基杆菌属（Methylobacterium）、水小杆菌属（Aquabacterium）、Terrisporobacter、劳尔氏菌属（Ralstonia）、柄杆菌属(Caulobacter)、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、新鞘脂菌属(Novosphingobium)、Pseudolabrys（图4B）。各样本独有属的物种相对丰度均在1.00%以下。

图4 各样本中内生细菌venn图与共有物种分析Figure 4 The venn diagram and common genus analysis

2.6 功能潜能预测

从KEGG一级功能预测结果中看出各竹龄毛竹茎干内生菌功能有所差异，KEGG分析中1 a生毛竹（S1）样本中内生细菌在环境信息处理中相对丰度要比其他竹龄样本高，而在新陈代谢、遗传信息处理和细胞进程则相反。遗传信息处理和生物体系统最高为5 a生样本，2、3和4 a生在各类通路中有着相似的丰度水平。

表3 不同竹龄毛竹茎干内生细菌KEGG代谢通路分析Table 3 Analysis of KEGG metabolic pathways of endophytic bacteria in the stems of Phyllostachys edulis at different ages

在二级功能结果中取相对丰度前25绘制功能热图，从图5中发现5个样本的功能集中在代谢与降解方面，其中关于碳水化合物代谢（carbohydrate metabolism）的相对丰度最高，氨基酸代谢（amino acid metabolism）、辅助因子和维生素的代谢（metabolism of cofactors and vitamins）和萜类化合物和聚酮类化合物的代谢（metabolism of terpenoids and polyketides）也具有较高的相对丰度。2～4 a生样本中外源生物降解与代谢（xenobiotics biodegradation and metabolism）、其他氨基酸的代谢（metabolism of other amino acids）和脂质代谢（lipid metabolism）有着一定的相对丰度，而这些功能在1 a生和5 a生样本中有着明显下降，这表示1 a生与5 a生毛竹在抵抗外界影响的能力不如其他竹龄样本。

图5 二级功能预测热图Figure 5 Secondary function prediction heatmap

3 讨论

毛竹幼林（1～5 a）生长速率较快，新竹长成后便不再进行干形生长，一般生长3～4 a后便可采伐利用，与木材的十几年甚至几十年的生长期相比有着巨大优势。因此，关于毛竹抚育和材质方面的研究颇多。植物在不同的生长阶段其内部环境差异明显，内生细菌所处的生长环境在不断变化，环境的变化促使内生细菌群落不断演替更新。关于毛竹不同生长阶段内生细菌的种群结构变化尚未见研究报道。本次研究不同竹龄的毛竹茎干内生细菌的多样性，发现在不同分类水平上，各个竹龄内生细菌的优势种群与丰度信息有显著差异，在内生细菌的丰富度与竹龄呈现正相关，且在内生细菌多样性会随着竹龄增加逐渐升高，但在到达第5年时却出现下降的趋势，在内生细菌差异上2～4 a生毛竹茎干样本差异较小，2 a生与3 a生之间内生细菌群落相似度极高，分析可能的因素，1～4 a毛竹生长活跃，合成大量的碳水化合物，这些物质可为内生菌的生长提供充足的养分，而在5 a后，毛竹生长减缓，木质素积累，内生菌生长受到一定的抑制作用。这样的变化，在内生细菌功能上也同样存在，2～4 a生竹竿内生细菌的生物学功能表现出来相似的结果，2～4 a生样本中外源生物降解与代谢、其他氨基酸的代谢和脂质代谢相对分度较高，这与1 a生和5 a生的竹竿中内生细菌功能差别较大，这同样表示1 a生与5 a生毛竹在抵抗外界影响的能力不如其他竹龄样本。

在本次研究发现，欧文氏菌属和苍白杆菌属在样本中占据优势地位，对毛竹生长的影响占据主导作用。并且苍白杆菌属只发现在毛竹茎干组织中分布，在对武夷山一度（1 a生）毛竹不同部位的内生细菌研究生中，同样只在茎干部位中发现苍白杆菌属，并且也是属于该样本中的优势菌属，而在根、鞭、叶以及根际土壤中并未发现苍白杆菌属有明显分布的情况[32-33]。该菌属在水稻、棉花和葡萄等常见在作物组织中也被发现，并在后续研究中发现其不会对宿主植株造成病害，反而发现其有一定的抗病能力[34-36]。与武夷山一度毛竹茎干内生细菌不同的还有链球菌属根瘤菌科的一些属在样本中属于优势菌属，但在以往研究中却未被发现，说明传统分离培养的方法有很大弊端，毛竹体内还有大量内生细菌未被分离出来进行研究。在1 a生和5 a生毛竹茎干中丰度占比最大的是欧文氏菌属，此菌属在毛竹其他部位的内生细菌研究中均未报道，欧文氏菌属是常见植物病原菌，但同时也有促生抗病能力的报道[37]，欧文氏菌只在特定竹龄的毛竹茎干中分布，可能与毛竹茎干内部环境的不同有关，毛竹前期生长迅速，茎干内有较大差异，导致欧文氏菌属的定殖效率所有变化，从而导致其相对丰度产生变化。

毛竹茎干中的内生细菌与其他部位有着明显差异，在毛竹根部以芽孢杆菌为主，鞭部以节细菌属为主。在毛竹根部更多分布的是芽孢杆菌、假单胞菌这种有着固氮促生抗病的细菌群落，这些细菌的富集和根部在植物所承担的功能有关，但这些菌属均未在茎干中有明显分布。毛竹茎干内生细菌的分布和生长发育造成的内生细菌群落演替以及外部细菌选择性定殖在植株特定部位这些现象是受到哪些因素影响，还需后续进一步的研究。