周朝彬，张小新，刘国蓉，龚 伟，杨永建，田正友，杨志武

（1.遵义师范学院生物与农业科技学院，贵州 遵义 563006；2.四川农业大学林学院，林业生态工程省级重点实验室，成都 611130；3.九龙县农牧农村和科技局，四川 九龙 626200；4.四川省林业科学研究院，成都 610084）

花椒为芸香科（Rutaceae）花椒属植物，广泛分布于亚洲、非洲、大洋洲和北美洲的热带和亚热带地区。在中国，主要分布于四川、甘肃、陕西、云南、重庆、山东、山西、贵州和河南等省市[1]。其果实（果皮）主要用作香料，同时也被用作传统中药，明确列入中华人民共和国药典[2]，经济价值高。近年来从花椒体内有效成分提取和活性鉴定表明，不同的提取物具有不同的药理活性，如抗抑郁[3]、抗肿瘤[4]和免疫调节活性[5]。

开花过程是植物生命周期中的重要事件[6]，决定结实情况，影响种植户经济收益。正常花椒以雌花为主，偶见雄花和两性花。近年来，贵州省关岭县和贞丰县等地广泛种植的顶坛花椒（Zanthoxylum planispinumvar.dintanensis）出现大量开雄花现象，部分植株雄花比例高达80%。花椒结实过程不需要授粉，可通过无融合生殖完成结实过程[7]，雄花花粉不是结实的必需条件[8]。有研究表明，大量开雄花表明顶坛花椒人工林退化，并可能与土壤水分含量下降导致的土壤养分供应不足有关[9]。由于雌花进一步发育为果实或种子，因而认为大量开雄花将显著节约资源[10]，可能是对养分缺乏的积极响应。

蛋白质组学通过研究蛋白质结构和功能，已经成为植物生理和生化过程研究的常用工具[11]。目前，蛋白质组学主要集中在杨树（Populussp.）、云杉（Picea glauca）、橡树（Quercus ilex）、桃树（Amygdalus persica）和桉树（Eucalyptus urophylla）等树种上，研究内容主要涉及器官（组织）发育、生物或非生物逆境胁迫响应等方面[12-14]。在花器官发育过程中，需要消耗物质和能量，且有各种激素如赤霉素、生长素、细胞分裂素以及脱落酸等参与[15]。在花器官发育过程中可鉴定到激素代谢、碳代谢和能量代谢等通路[16-18]。花器官发育过程中往往遭受环境胁迫，因而还可鉴定到胁迫相关蛋白[18]。对月季（Rosa hybrida）花瓣发育研究发现大量胁迫相关蛋白，如过氧化物酶（peroxidase）、过氧化氢酶（catalase）以及热休克蛋白（HSPs）等[19]。单性花中，雌花与结实密切关联，而雄花的花粉在植物的繁殖中起着决定性作用[20]，因而雌花（柱头）和雄花（花粉或花药）发育相关的差异蛋白及调控途径也受到学者关注。在雌雄异株红瓜（Coccinia grandis）雌花芽中显著上调蛋白为乙烯生物合成（ethylene biosynthesis）相关差异蛋白如UBP1-associated protein 2A、UBP1-associated protein 2C、乙烯形成酶（ethylene-forming enzyme），并鉴定到一些与花粉萌发和花粉管伸长有关的差异蛋白[21]。欧洲油菜（Brassica napus）的柱头发育相关蛋白主要参与代谢过程（metabolic processes）、刺激或胁迫响应（responses to stimulus or stress）、发育过程（developmental processes）和运输（transport）等过程，与小黑麦非常相似[22]。在果梅（Prunus mumeSieb.et Zucc.）完全花中发现了1个上调蛋白、21个下调蛋白，在不完全花中仅鉴定到2个差异蛋白，推测这些蛋白差异点与雌蕊的败育关联[23]。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）成熟花粉发育过程中，鉴定到的135个特异蛋白，主要参与能量代谢（energy metabolism）、细胞壁代谢（cell wall metabolism）、细胞结构和蛋白质合成（cell structure and protein synthesis）。其中，糖基水解酶（glycosyl hydrolases）、果胶甲酯酶抑制剂（pectin methylesterase inhibitor）等是花粉发育特异蛋白[24]。有关雌雄异花同株的木本植物花芽发育的蛋白质组学研究十分缺乏。

目前，已有学者初步研究了顶坛花椒大量开雄花的生态学机制，发现树体退化程度与雄花比例密切相关，而植株衰老退化越严重，土壤养分含量越低[25]。然而，对顶坛花椒花芽发育的蛋白质组学研究报道还极少。顶坛花椒雌雄花芽发育的差异蛋白表达有何特征，雄花发育过程中是否体现出对土壤养分贫瘠的适应特征，尚不清楚。为此，本文比较了不同发育阶段雌雄花芽蛋白表达及代谢通路特征，以期从蛋白水平上揭示顶坛花椒雌雄花芽发育的分子机制，同时为顶坛花椒雌雄花调控提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

在贵州省关岭布依族苗族自治县板贵乡（25.676°N，105.657°E）设置样地并采集顶坛花椒花芽样品。样地气候为亚热带湿润季风气候，年降水量1 100 mm，年均气温18.4℃。样地海拔530 m，该区域石漠化严重，基岩裸露率高达50%～80%。土壤主要为石灰土。顶坛花椒主要为2010年左右栽植（树龄10～12年生）。在花椒人工林内随机选择样树8株（其中大量开雄花植株4株，仅开雌花植株4株），在树冠中部外围的东南西北4个方向进行取样。顶坛花椒雄花先于雌花开放。分别于2020年11月上旬、2021年2月下旬和3月中旬采集花序轴分化期的花芽、雄花芽和雌花芽，各时期分别采集花芽3～4 g，3种花芽均设置3个重复。部分花芽湿巾包裹后，置于4℃冷藏箱带回实验室采用DMSZ8视频一体机拍照（图1）。另一部分立刻放入液氮中带回实验室，置于-80℃冰箱中保存，用于蛋白质组学分析。

图1 顶坛花椒不同发育时期花芽形态特征Figure 1 Morphological characteristics of Zanthoxylum planispinum var.dintanensis flower buds in different development stages

1.2 蛋白质组学分析

1.2.1 蛋白提取

将顶坛花椒不同发育时期花芽样品从-80℃冰箱中取出，称取适量样品至液氮预冷的研钵中，加液氮充分研磨至粉末。蛋白提取具体步骤参照黄峤璟关于小麦旗叶蛋白提取方法[26]。

1.2.2 胰酶酶解

顶坛花椒不同发育时期花芽样品蛋白取等量进行酶解，具体酶解过程参照文献[26]。

1.2.3 串联质谱标签（TMT）标记

用Strata X C18（Phenomenex）对胰酶酶解的肽段进行除盐后，真空冷冻并干燥。采用0.5 M TEAB溶解肽段，标记肽段参考TMT试剂盒的操作说明。

1.2.4 高效液相色谱（HPLC）分级

用高pH反相HPLC对肽段进行分级，色谱柱为Agilent 300Extend C18。详细分级操作步骤参照文献[26]。

1.2.5 液相色谱-质谱联用分析

将超高效液相系统分离后的肽段注入NSI离子源中进行电离，然后开展Orbitrap Exploris™480质谱分析。离子源电压水平、FAIMS补偿电压(CV)水平、一级质谱扫描范围和分辨率、二级质谱扫描范围和分辨率等设置及操作步骤参照文献[26]。

1.3 PRM定量

1.3.1 液相色谱-质谱联用分析

肽段用液相色谱流动相A相溶解后使用EASY-nLC 1000超高效液相系统进行分离。流动相A为含甲酸（0.1%）和乙腈（2%）的水溶液；流动相B为含甲酸（0.1%）和乙腈（90%）的水溶液。液相梯度设置：0～16 min，7%～25%B；16～22 min，25%～35%B；22～26 min，35%～80%B；26～30 min，80%B，流速维持在500 nL/min。

采用超高效液相系统分离肽段后，将肽段注入NSI离子源中进行电离，随后进行Q ExactiveTM Plus质谱分析。具体步骤参照李琳[27]方法并略有改动。改动之处为：设置一级和二级质谱最大离子注入时间（maximum IT）分别为50 ms和200 ms，设置隔离窗口（isolation window）为1.6 m/z。

1.3.2 数据处理

参照文献进行肽段参数设置[28]。

1.4 差异蛋白功能分析和通路富集

采用基因本体（gene ontology，GO）基于eggNOG数据库对差异蛋白功能进行注释，从3个类型（生物学过程、细胞组分和分子功能）进行功能富集。采用KEGG数据库(http：//www.kegg.jp/)进行差异蛋白的通路富集分析，采用费希尔精确检验（Fisher′s exact test）对蛋白功能和合成通路富集分析进行显著性检验（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 差异蛋白及功能鉴定

顶坛花椒不同发育阶段花芽中总计鉴定到4 742个差异蛋白。皮尔森相关分析表明，3个发育阶段顶坛花椒花芽的生物学重复的重现性非常好(图2a)。与花序轴分化期花芽相比，雄花芽中鉴定到2 511个差异蛋白，雌花芽中鉴定到2 195个差异蛋白。而与雌花芽相比，雄花芽中仅鉴定到667个差异蛋白(图2b)。表明大部分差异蛋白是雄花芽和雌花芽发育共同需要的，仅有部分差异蛋白是雄花芽或雌花芽发育过程中所必需的。

进一步对差异蛋白特征采用韦恩分析发现，与花序轴分化期花芽相比，雄花中显著上调蛋白1 329个，显著下调蛋白1 182个，雌花中显著上调蛋白1 196个，显著下调蛋白999个（图2b）。在雄花芽中上调且在雌花芽下调的差异蛋白共有9个，在雄花芽中下调且在雌花芽中上调的差异蛋白共有7个(图3，表1)，表明这些蛋白分别与雄花和雌花发育特异相关。

表1 与顶坛花椒雄花/雌花发育特异相关的差异蛋白Table 1 Differential proteins specially associated with male/female flower buds development

图2 采用TMT标记定量法对差异蛋白进行定量鉴定结果Figure 2 Quantitative identification of differential proteins by TMT quantification

图3 不同发育阶段花椒花芽差异蛋白的韦恩分析Figure 3 The differential proteins of Zanthoxylum planispinum var.dintanensis flower buds in different development stages showed in Venn diagrams

2.2 差异蛋白的GO功能分析

对不同发育阶段花椒花芽差异蛋白GO注释发现，在生物过程中，有11个功能存在显著差异。其中，细胞过程、代谢过程和刺激响应等功能有关的差异蛋白占比较大。在细胞组分中，细胞、细胞内和含蛋白质复合物在不同花芽间差异蛋白显著。在分子功能中，不同花椒花芽差异蛋白在催化活性、结合以及转运体活性等7个功能方面有显著差异（图4）。

图4 差异蛋白的GO功能注释Figure 4 GO function annotation of differential expressed proteins

2.3 KEGG通路分析

与花序轴分化期花芽相比，在雄花芽中，上调蛋白显著富集到12条通路中，差异蛋白主要与萜类化合物骨架生物合成（terpenoid backbone biosynthesis）、类黄酮生物合成（flavonoid biosynthesis）以及吞噬体（phagosome）等通路相关；在雌花芽中，上调蛋白显著富集到11条通路中，差异蛋白主要与核糖体（ribosome）、类黄酮生物合成以及吞噬体等相关。与雌花芽相比，雄花芽中的上调蛋白主要富集于10条通路中，差异蛋白主要与类黄酮生物合成、类胡萝卜素生物合成（carotenoid biosynthesis）以及泛素酮和其他萜醌生物合成（ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis）等有关（表2）。

表2 顶坛花椒雌雄花芽上调差异蛋白的KEGG通路富集结果（-log10（费希尔精确检验P值））Table 2 KEGG pathway enrichment results of up-regulated differential proteins in male and female flower buds of Zanthoxylum planispinum var.dintanensis（-log10(Fisher’s exact test p value)）

2.4 PRM验证

在差异蛋白中，随机挑选了8个蛋白进行PRM验证。验证结果表明，不同花芽比较组中，8个差异蛋白的PRM和TMT的定量结果一致(表3)。

表3 TMT标记定量与平行反应监测(PRM)结果的比较Table 3 Comparison between the TMT-tagged quantification techniques(TMT)and parallel reaction monitoring(PRM)results

3 讨论

3.1 参与顶坛花椒雌雄花芽发育的代谢通路

顶坛花椒雌雄花芽发育中大部分通路（8条）相同（表2），共同通路主要参与萜类和多酮的代谢和次生代谢。在这些通路中，萜类化合物骨架生物合成通路，属于萜类和多酮的代谢。萜类化合物是植物体内的一种代谢产物，与脱落酸等植物激素合成密切关联，一些萜类在提高植物对环境的适应上发挥着重要作用[29-30]。在Ceratopteris研究中发现，内源脱落酸可能会抑制雄蕊发育[31]。锥栗雌花中脱落酸含量比雄花低[32]，表明脱落酸参与调控花芽发育过程。本实验研究也发现，顶坛花椒雌雄花芽发育过程中均有类胡萝卜素生物合成通路，该通路可合成ABA，表明内源激素如ABA可能参与顶坛花椒雌雄花芽发育调节。类黄酮生物合成通路的产物类黄酮在促进授粉以及提高植物防御能力等方面具有显著作用[33]。在菊花（Chrysanthemum morifolium）、杜鹃（Rhododendron×pulchrumSweet cv.Oomurasaki）等植物中发现该通路参与调控花器官发育过程[34-35]。单萜生物合成（monoterpenoid biosynthesis）的产物单萜，在植物吸引昆虫传粉、防御植食性动物和控制病虫害发生等方面发挥着重要功能[36]。

试验中还发现上调差异蛋白显著富集的核糖体通路仅出现在雌花芽发育过程中（表2）。该通路属于遗传信息加工中的翻译，对植物繁殖和生存有重要作用[37]。深入分析发现，相对于雌花芽而言，顶坛花椒雄花芽发育过程中的上调差异蛋白显著富集的通路中，鉴定到脂肪酸降解（fatty acid degradation），缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解（valine，leucine and isoleucine degradation）等代谢通路，表明与雌花芽相比，雄花芽发育对氨基酸和脂肪酸需求更低，可能有利于对喀斯特石漠化地区土壤养分贫瘠的适应[38]。

3.2 特异参与顶坛花椒雌雄花发育的差异蛋白

与花序轴分化期花芽相比，在雄花芽中上调且雌花芽中下调的差异蛋白共鉴定到9个，这些蛋白很明显参与了花椒雄花芽的发育过程，在雌花芽中上调且雄花芽中下调的差异蛋白共鉴定到7个，这些蛋白显著参与了花椒雌花芽的发育过程(表1)。其中，脂肪酰-CoA还原酶（Fatty acyl-CoA reductase）参与调控花粉外壁物质的合成[39]。与花序轴分化期花芽相比，在雄花芽中显著上调（差异倍数达2.665），而在雌花芽中显著下调（差异倍数为0.763），表明该蛋白与雄花发育密切相关。含果胶裂解酶3结构域的蛋白（Pectate_lyase_3 domaincontaining protein）的GO注释表明其参与生殖、花粉发育、花粉壁组装以及花粉外膜形成等生物学过程，调节顶坛花椒雄花发育。α-半乳糖苷酶（alpha-galactosidase）可能通过介入细胞壁松弛和细胞壁扩张，进而调节器官的发育[40]，参与花椒雄花发育。

特异参与雌花发育的差异蛋白中，含核酸外切酶的结构域蛋白（exonuclease domain-containing protein）在GO注释中的功能为DNA结合、复制和聚合酶活性，参与遗传信息处理中的真核生物中的核糖体生物发生通路。内质网跨膜蛋白的GO注释中，功能为可能在膜蛋白从内质网向高尔基体的顺行转运中起作用。含H15的结构域蛋白（H15 domain-containing protein）的GO注释功能为DNA结合、核小体组装功能。腺嘌呤磷酸核糖转移酶（adenine phosphoribosyltransferase）参与嘌呤代谢通路，催化回收反应并生成AMP（单磷酸腺苷），可能有助于腺嘌呤循环生成腺苷酸[41]。含酰胺酶的结构域蛋白（amidase domain-containing protein）的GO注释功能为水解酶活性。综上，这些特异参与雌花发育的差异蛋白通过提供遗传代谢物质，或在DNA复制、结合等过程中发挥作用，确保DNA复制的效率和准确性[42]。