孙 浩 李 姣 张小燕 郭 滨 毕宏生 王兴荣

葡萄膜黑色素瘤是眼科临床常见的眼内原发性恶性肿瘤之一，按发病部位可分为睫状体黑色素瘤、脉络膜黑色素瘤，其中脉络膜黑色素瘤发病率最高，占葡萄膜黑色素瘤的85%以上[1]。研究发现，高增殖活性及易发生眼外转移是导致葡萄膜黑色素瘤诊疗困难及患者死亡率高的主要原因，并且肿瘤的生长和转移被认为是一个依赖于血管形成才能完成的过程，有超过 90%的患者会因此死于肝转移[2]。现有的研究证实，血管内皮生长因子(VEGF)是一种血管内皮细胞有丝分裂原，能使血管内皮细胞发生形态变化、转移、分裂，进而促进新生血管形成和增强血管通透性[3]。因此，抑制肿瘤VEGF的生成被认为是一种有效的抗肿瘤治疗策略[4]。

石蒜碱从石蒜的鳞茎中提取而来，属于吡咯苯三甲酸生物碱类抗氧化剂，拥有广泛的抗病毒、抗炎、抗肿瘤等作用[5]。近年来，石蒜碱的潜在抗肿瘤特性受到了广泛的关注。以往的研究表明，石蒜碱对乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、多发性骨髓瘤、肝细胞癌、胃癌等多种恶性肿瘤具有一定的抑制作用[6]。Cao 团队在研究侵袭性极高的卵巢癌 Hey1B细胞时发现，盐酸石蒜碱在体内可以显著抑制异种移植的 Hey1B 小鼠体内卵巢癌细胞新生血管的生成，并且能够抑制血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)、血管内皮生长因子(VEGF)和信号素 4D(Sema4D)等血管生成关键基因的表达[7-8]。因此，我们推测石蒜碱可能可以通过抑制VEGF的表达，进而对葡萄膜黑色素瘤细胞产生强烈的抑制作用，从而达到抗葡萄膜黑色素瘤的目的。故本研究重点探讨石蒜碱对葡萄膜黑色素瘤细胞的影响，并分析其潜在的作用机制，为石蒜碱用于葡萄膜黑色素瘤的治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料B16F10 细胞株购自中国科学院细胞库。石蒜碱(北京仪化通标科技有限公司，分子式C16H17NO4,HPLC≥98%，使用含体积分数 0.1% DMSO 的 DMEM 配制为不同浓度用于实验);胎牛血清(GICO公司，美国);DMEM 培养液(Hyclone公司，美国)。ELISA试剂盒(上海将来实业股份有限公司)；流式细胞仪细胞周期与凋亡试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；CCK-8试剂盒和PCR试剂盒(山东思科捷生物科技有限公司)。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。裂隙灯显微镜(ZEISS，德国)；高倍显微镜(Leica-M841型，德国)；Bio-Tek酶标仪(ELX-800，美国)；流式细胞仪(BD FACSVerse，美国)；快速温度梯度PCR仪(TaKaRa，日本)；荧光定量PCR(RT-PCR)仪(罗氏480，德国)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组B16F10细胞使用含体积分数10% 胎牛血清和100 mg·L-1链霉素、100×103U·L-1青霉素的高糖DMEM培养基，置于37 ℃、体积分数5% CO2无菌培养箱中培养，2.5 g·L-1胰蛋白酶消化、传代，取3～6代细胞用于实验。实验分6组，分别为0 μmol·L-1组(对照组)、1.560 μmol·L-1组、3.125 μmol·L-1组、6.250 μmol·L-1组、12.500 μmol·L-1组、25.000 μmol·L-1组，在B16F10细胞的DMEM培养基中分别加入相应浓度的石蒜碱处理细胞，其中，对照组B16F10细胞正常培养，不添加石蒜碱。

1.2.2 CCK-8法检测细胞存活率将密度为1×104个·mL-1的B16F10细胞悬浮液接种到96 孔板内，置于37 ℃、体积分数5%CO2的培养箱中常规培养 24 h。去上清，分组处理细胞(每组设3个复孔)后，继续培养 24 h。每孔加入 10 μL的 CCK-8 溶液，无菌培养箱孵育1 h后，酶标仪450 nm波长检测各孔光密度(D)，实验重复3次。描绘生长曲线，计算半数抑制浓度(IC50)。

1.2.3 RT-PCR检测各组细胞VEGF-A mRNA 的表达水平B16F10细胞分组处理24 h后，离心收集各组细胞，按照试剂盒说明书提取RNA，用微量紫外可见光分光光度计定量RNA浓度，然后采用逆转录试剂盒逆转录合成 cDNA。引物序列：VEGF-A mRNA上游引物为5’-GCCCTTGCCTTGCTGCTCTACC-3’，下游引物为5’-GTGATGATTCTGCCTCCTCCTTC-3’；β-actin上游引物为5’-TCATGCGGATCAAACCTCACC-3’，下游引物为5’-TCACCGCCTTGGCTTGTCAC-3’。参照RT-PCR试剂盒说明书进行扩增，反应条件为:95 ℃ 3 min 预变性；95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,40 个循环，然后 95 ℃ 60 s,60 ℃ 60 s。实验重复2次。

1.2.4 ELISA检测各组细胞VEGF-A蛋白的表达B16F10细胞分组处理24 h后，收集细胞上清液200 μL,严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作，检测各组VEGF-A蛋白表达情况。

1.2.5 流式细胞仪检测

1.2.5.1 细胞周期检测取生长状态良好并且处于对数生长期的B16F10细胞，经 PBS 清洗、胰蛋白酶消化计数后，按每孔3×105个细胞接种于6孔板上，于 37 ℃、体积分数5%CO2饱和湿度培养箱内培养 24 h。去上清，分组处理后继续培养 24 h，1000 r·min-1离心 4 min，沉淀细胞。加入1 mL冰浴预冷的PBS重悬细胞，并转移到1.5 mL离心管内。加入1 mL冰浴预冷体积分数70%乙醇，轻轻吹打混匀，4 ℃固定12 h。将固定好的细胞离心去除乙醇，用预冷的 PBS 轻轻清洗 2遍后，加入0.5 mL 预冷的 PBS 重悬细胞。每管细胞样品中加入按照细胞周期检测试剂盒说明书配制的碘化丙啶染色液0.5 mL，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37 ℃避光温浴30 min，流式细胞仪行细胞周期检测。

1.2.5.2 细胞凋亡检测B16F10细胞经PBS清洗、胰蛋白酶消化计数后，按每孔3×105个细胞接种于6孔板上，培养箱内培养 24 h后去上清，分组处理后继续培养24 h，收集细胞和培养上清，细胞使用PBS洗涤，加入适量胰蛋白酶消化液消化，2 min后加入刚才收集的细胞培养上清，1000 r·min-1离心4 min，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。取(5～10)×104个重悬的细胞，1000 r·min-1离心5 min，弃上清，加入195 μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC，最后加入10 μL碘化丙啶染色液轻轻混匀。室温(20～25 ℃)避光孵育15 min，随后置于冰浴中，使用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。

2 结果

2.1 CCK-8法检测石蒜碱作用后各组细胞存活率CCK-8法检测结果显示，对照组、1.560 μmol·L-1、3.125 μmol·L-1、6.250 μmol·L-1、12.500 μmol·L-1、25.000 μmol·L-1石蒜碱作用于B16F10细胞24 h后，各组细胞存活率分别为100.00%、97.27%、89.67%、68.35%、36.65%、1.72%。可见，随着石蒜碱作用浓度的增加，B16F10细胞存活率逐渐降低。根据细胞生长曲线,计算得出石蒜碱的IC50为7.950 μmol·L-1。

2.2 RT-PCR检测各组细胞 VEGF-A mRNA表达RT-PCR检测结果显示，对照组、1.560 μmol·L-1组、3.125 μmol·L-1组、6.250 μmol·L-1组、12.500 μmol·L-1组、25.000 μmol·L-1组B16F10细胞VEGF-A mRNA相对表达量分别为1.00±0.01、0.95±0.02、0.82±0.01、0.78±0.01、0.69±0.01、0.58±0.01。各组B16F10细胞间VEGF-A mRNA相对表达量差异有统计学意义(F=186.90，P=0.003)。两两比较结果显示，与对照组相比，12.500 μmol·L-1组、25.000 μmol·L-1组石蒜碱下调B16F10细胞VEGF-A mRNA的表达较为显著(均为P<0.01)，3.125 μmol·L-1，6.250 μmol·L-1组石蒜碱下调VEGF-A mRNA的表达也较明显(均为P<0.05)，差异均有统计学意义；与对照组相比，1.560 μmol·L-1组B16F10细胞VEGF-A mRNA的表达下降不明显，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 ELISA检测各组细胞VEGF-A蛋白表达ELISA检测结果显示，对照组、1.560 μmol·L-1组、3.125 μmol·L-1组、6.250 μmol·L-1组、12.500 μmol·L-1组、25.000 μmol·L-1组B16F10细胞VEGF-A蛋白含量分别为(97.06±0.75)ng·L-1、(80.22±0.18)ng·L-1、(71.36±0.14)ng·L-1、(68.49±0.10)ng·L-1、(62.95±0.39)ng·L-1、(56.11±0.20)ng·L-1，各组B16F10细胞间VEGF-A蛋白含量差异有统计学意义(F=278.50，P=0.002)。两两比较结果显示，与对照组相比，12.500 μmol·L-1、25.000 μmol·L-1组B16F10细胞VEGF-A蛋白含量下降较为显著(均为P<0.01)，3.125 μmol·L-1，6.250 μmol·L-1组VEGF-A含量下降也较为明显(均为P<0.05)，差异均有显著统计学意义；与对照组相比，1.560 μmol·L-1组B16F10细胞VEGF-A含量下降不明显，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 流式细胞仪检测

2.4.1 流式细胞仪检测细胞周期流式细胞仪检测细胞周期结果显示，石蒜碱干预B16F10细胞24 h后，G1期细胞比例明显增加，G2期细胞比例明显减少，各组B16F10细胞间G1期、G2期细胞比例差异均有统计学意义(均为P<0.05)，S期细胞比例差异无统计学意义(P=0.329)。两两比较结果显示，不同浓度石蒜碱组与对照组相比，B16F10细胞间G1期、G2期细胞周期比例差异均有统计学意义(均为P<0.05)，其中25.000 μmol·L-1组石蒜碱G1期细胞比例上升与G2期细胞比例下降最为明显，与其他浓度石蒜碱组相比，差异均有统计学意义(均为P<0.05)(表1)。

表1 流式细胞仪检测各组细胞周期结果

2.4.2 流式细胞仪检测细胞凋亡流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示，对照组破碎、坏死细胞的比例为0.04%,细胞凋亡率为0.00%;1.560 μmol·L-1组、3.125 μmol·L-1组、6.250 μmol·L-1组、12.500 μmol·L-1组、25.000 μmol·L-1组的石蒜碱处理B16F10细胞24 h后，破碎、坏死细胞的比例分别为7.43%、7.56%、7.44%、7.88%、8.38%,细胞凋亡率分别为12.80%、12.86%、16.68%、18.54%、22.20%。与对照组相比，12.500 μmol·L-1组、25.000 μmol·L-1组的石蒜碱干预24 h后，细胞凋亡比例明显上升,正常细胞比例明显下降(分别占72.04%和68.43%)。表明石蒜碱可以显著促进B16F10细胞的凋亡，并呈浓度依赖性(图1)。

图1 石蒜碱作用B16F10细胞后流式细胞仪检测细胞凋亡结果

3 讨论

葡萄膜黑色素瘤是起源于葡萄膜黑色素细胞的眼内恶性肿瘤，虽然相对罕见，但恶性程度极高，且极易发生转移[9]。葡萄膜黑色素瘤起病隐匿，早期无典型症状，容易漏诊或误诊，确诊时患者病情往往已进展至中后期，治疗难度提升。尽管现有的诊疗手段不断进步，但患者总体生存率依然较低，预后不佳[10]。目前手术切除能够挽救大多数原发性葡萄膜黑色素瘤患者的生命，但超过50%的葡萄膜黑色素瘤会发生扩散，一旦发生扩散，5年生存率仅为43%[11]。研究表明，肿瘤的产生、发育及扩散均依赖血管提供必要的营养物质，运走代谢废物，以利于肿瘤快速繁殖，并且新生血管也为肿瘤细胞向远处转移提供了条件[12]。如果能成功阻断或抑制肿瘤血管的新生，切断其营养途径，肿瘤细胞将会停止增殖而死亡，从而达到治疗肿瘤的目的，这也正是国际上饱受关注的抗肿瘤血管形成疗法[13]。

石蒜碱作为从石蒜科植物中提取出的一种活性生物碱，具有抗病毒、抗细菌、抗过敏、抗疟疾等多种生物学作用[14]。随着对石蒜碱研究的不断深入人们发现,石蒜碱不但能够调节绝大多数肿瘤分子靶点及信号通路，还可以抑制肿瘤细胞的生长和转移，影响细胞周期，诱导肿瘤细胞发生凋亡[15]，以往的研究发现，石蒜碱对白血病、多发性骨髓瘤、前列腺癌、肝细胞癌和乳腺癌等肿瘤细胞具有较强的选择性抑制作用[16]。Liu 等[17]在体外研究中发现，石蒜碱通过诱导髓细胞白血病基因-1(Mcl-1)蛋白水平的降低，而触发内源性线粒体途径诱导的人白血病细胞凋亡。Jin 等[18]研究表明，石蒜碱可以抑制多发性骨髓瘤细胞增殖中起重要作用的 JAKS-TAT 信号通路，从而诱导多发性骨髓瘤细胞的死亡。Hu等[19]研究阐明，石蒜碱能够通过调节STAT的表达来抑制前列腺癌细胞生长。Yu等[20]研究报道，石蒜碱通过失活TCRP1/Akt/mTOR通路从而促进人肝癌细胞的自噬和凋亡。Ji 等[21]在石蒜碱抗人乳腺癌细胞的实验中发现，石蒜碱可通过死亡受体途径诱导人乳腺癌细胞 MCF-7 的凋亡。但迄今为止，石蒜碱对葡萄膜黑色素瘤细胞的作用研究较少，机制尚不明确，阻碍了石蒜碱在眼科抗肿瘤药物中的开发与应用。

以往研究证实，肿瘤细胞的生长、增殖和扩散与异常血管生成密切相关[22]。而VEGF在新生血管中扮演着重要的角色。在本实验中，我们利用分子生物学技术研究了石蒜碱对葡萄膜黑色素瘤细胞的作用，并探讨了可能的机制。石蒜碱干预葡萄膜黑色素瘤细胞24 h后，CCK-8法检测结果显示，石蒜碱可以有效地抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的生长，降低其细胞活性，IC50为 7.950 μmol·L-1。同时，ELISA和RT-PCR检测VEGF-A蛋白和VEGF-A mRNA结果显示，石蒜碱能够显著抑制VEGF-A的表达，其中12.500 μmol·L-1和25.000 μmol·L-1的石蒜碱抑制效果显著。流式细胞仪检测结果提示，石蒜碱能够诱导葡萄膜黑色素瘤细胞凋亡，并且使细胞周期阻滞在S期，进而影响肿瘤细胞增殖。

综上所述，本研究发现，石蒜碱可以诱导葡萄膜黑色素瘤细胞发生凋亡，引起细胞S期阻滞，进而降低细胞活性、抑制细胞增殖，其机制可能与石蒜碱能够下调VEGF-A mRNA的表达、抑制VEGF-A蛋白分泌水平，进而拮抗VEGF的生成有关。本研究进一步证实了石蒜碱对葡萄膜黑色素瘤细胞具有浓度依赖性的抑制作用，表明石蒜碱有潜力成为未来临床治疗葡萄膜黑色素瘤的候选药物。