倪春辉,李惠霞,刘永刚,韩 变,石明明,魏雪娟,李文豪,徐雪芬

(1.甘肃农业大学 植物保护学院/甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室,兰州 730070;2.甘肃省农业科学院 植物保护研究所,兰州 730070)

1945年,Thorne对引起马铃薯块茎腐烂的线虫进行了形态特征描述,并将其作为一个单独的种从鳞球茎线虫中分离出来,命名为腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)[1]。该线虫广泛分布于温带地区[2-3]。在国外,该线虫主要危害马铃薯[4]。在国内主要危害甘薯[5]和当归[6-8],也可危害马铃薯和党参[9-10]。该线虫可侵染90～120种植物,取食40个属70多种真菌[11]。不同来源腐烂茎线虫ITS-r DNA序列存在差异[3,12],国内许多研究表明,不同来源腐烂茎线虫ITS-r DNA序列存在A(L)型与B(S)型两类[13-15]。2010年,Subbotin等[16]发现GenBank中70多个群体间的主要差异出现在ITS1区二级结构H9螺旋区域,并将上述群体划分为A-G 7个基因型。甘肃农业大学线虫实验室发现来自当归和党参的腐烂茎线虫群体与A-G基因型在二级结构上存在差异,不能归类为A-G基因型,可能存在新基因型(待发表)。

研究表明,不同来源腐烂茎线虫群体致病性存在差异,在不同繁殖材料上的繁殖速率也不相同[17-21]。王宏宝等[21]将A、B基因型群体接种于甘薯,发现在感病品种上繁殖量最大的群体偏雌化。了解不同来源腐烂茎线虫的致病性差异,有利于作物的准确选择及轮作制度的制定。本研究拟测定不同群体的致病性,以期明确腐烂茎线虫不同群体间的致病性差异,为该线虫的防治提供有效理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试线虫分离自马铃薯、当归和党参病样,详细信息见表1。

表1 供试腐烂茎线虫群体信息Table 1 Population information of Ditylenchus destructor

供试植物马铃薯购自定西市农科院‘新大坪品种’,甘薯购自河南省‘烟薯25号’品种,党参为岷县农家品种。

1.2 盆栽种植

参照徐鹏刚[22]方法,采用16 cm×17 cm花盆种植党参,18 cm×12 cm花盆种植马铃薯,25 cm×30 cm花盆种植甘薯。所用基质为土壤∶腐殖质∶沙子=2∶2∶1(体积比),经高压蒸汽121℃灭菌2 h后晾凉备用。将党参苗和马铃薯块茎于75%酒精中1 min,用无菌水冲洗3遍后浸入2.5% NaClO(有效氯含量)溶液中消毒10 min,最后再冲洗3遍;剪除甘薯苗根部(排除须根内线虫的影响),随后浸没在75%酒精10 s后,在2.5% NaCl O(有效氯含量)溶液中处理3 min,最后用无菌水冲洗3遍。将消毒后的种苗及块茎种植于基质中,浇水保湿。党参、甘薯和马铃薯各种植21盆(1株/盆)。

1.3 线虫接种

线虫悬浮液制备:采用改良贝曼漏斗法分离在茄镰孢培养的腐烂茎线虫,经200目和600目套筛冲洗真菌孢子后,将线虫移至1.5 m L离心管,以3 000 r/min离心2 min沉淀线虫且定容至1 m L。漩涡震荡均匀,吸取100μL线虫悬浮液,在显微镜下重复3次统计线虫数量,计算线虫悬浮液浓度。

线虫接种:种苗种植30 d后,用移液枪将线虫悬浮液接入植物根系附近,每盆接入大约500条各龄期混合线虫。接种60 d后,观察线虫危害情况,并采用改良贝曼漏斗法[23]分离线虫,统计线虫数量:线虫数(条/g)=分离线虫总数/组织质量;线虫繁殖系数=最终线虫总数/接种量(500条)。

1.4 茎线虫病分级标准

甘薯茎线虫病分级标准参考王宏宝[24]的方法:0级:无症状;1级:发病面积占甘薯块根横切面积的25%以下;2级:发病面积占甘薯块根横切面积的25%～50%(不含);3级:发病面积占甘薯块根横切面积的50%～75%(不含);4级:发病面积占甘薯块根横切面积的75%及以上。

马铃薯茎线虫病分级标准参考林茂松[25]的方法:0级:无症状;1级:发病面积占马铃薯块茎横切面积的25%以下;2级:发病面积占马铃薯块茎横切面积的25%～50%(不含);3级:发病面积占马铃薯块茎横切面积的50%～75%(不含);4级:发病面积占马铃薯块茎横切面积的75%及以上。

党参茎线虫病分级标准参考刘学周[26]当归麻口病分级标准:0级:无症状;1级:发病面积占党参表面面积的1/2以下;2级:发病面积占党参表面面积的1/2～2/3(不含);3级:发病面积占党参头部表面面积的2/3;4级:发病严重,已无完整头部。

1.5 数据统计与分析

用软件Excel 2016进行数据统计,使用软件SPSS 19.0采用Duncan’s法对所有数据进行P＜0.05水平的方差分析。

2 结果与分析

2.1 腐烂茎线虫群体对寄主的致病性

接种腐烂茎线虫60 d后,马铃薯、甘薯和党参发病情况见表2。结果表明,在接种500条/盆的情况下,6个不同来源群体均可侵染马铃薯,4个群体可以侵染甘薯,但6个群体均未侵染党参。马铃薯的C型群体DXP2、SXP1、HLJP1和党参B型群体TCC1可以侵染马铃薯和甘薯。

表2 腐烂茎线虫对不同作物侵染情况Table 2 Infection of D.destructor to different crops

2.2 腐烂茎线虫群体对甘薯的致病性差异和症状特点

4个腐烂茎线虫群体中马铃薯群体SXP1致病力显著大于其他群体(表3,图1-B),致病级数达3.67,线虫数量也显著多于其他群体,繁殖系数为30.43。其次为DXP2,致病级数为3.33,繁殖系数为3.50。HLJP1致病级数为2.33,繁殖系数为3.80,其致病力弱于DXP2,但繁殖系数略大于DXP2。党参群体TCC1致病力和繁殖系数均低于其他群体,致病级数只有1级,且繁殖系数只有0.28,分离数量少于接种数量(500条/盆)。接种后各虫态统计结果显示,所有群体的幼虫数量均最多,除群体TCC1外,其他群体雌雄比接近1∶1。C基因型3个群体中,HLJP1与其他群体致病级数具有显著性差异,SXP1和DXP2与B基因型群体TCC1致病级数具有显著性差异。

图1 不同来源腐烂茎线虫侵染甘薯症状Fig.1 Symptoms of sweet potato infected with D.destructor from different sources

表3 腐烂茎线虫不同群体对甘薯侵染情况Table 3 Infection of D.destructor from different sources to sweet potato

甘薯不同部位分离线虫结果显示,腐烂茎线虫主要集中分布于块根。采用削皮器将甘薯块根削皮,分离薯皮和薯肉中的线虫(表3),发现党参群体TCC1在甘薯薯皮中的数量多于薯肉中,其他群体均为薯肉中数量较多。同时,茎、根和土壤中腐烂茎线虫极少,大部分样品未分离到腐烂茎线虫,只有少数样品分离得到1～5条线虫。

发病症状观察发现,甘薯地上部、根系和茎基部未见明显症状,块根表皮发现有黑褐色斑点,发病严重时,薯块表皮黑色斑点连接成片。削去表皮,可见黑色表皮下呈现黑褐色和白色相间的干腐症状,有些部位呈糠腐状。切开薯块,可见病斑由表皮向内延伸,发病严重时,薯块中心呈黑褐色和白色相间的干腐状糠心。

2.3 腐烂茎线虫群体对马铃薯的致病性差异分析和症状特点

供试6个群体对马铃薯致病力总体较弱。其中群体DXP2致病力最强(表4,图2-D),致病级数为2.00,繁殖系数为2.50,但线虫数量少于HLJP1。群体HLJP1繁殖数量最多,繁殖系数为4.11,显著高于其他群体。群体DXP2和HLJP1繁殖数量大于接种数量,其他群体均为分离数量少于接种数量(500条/盆),且致病级数均小于2级,繁殖系数为0.002～0.59。统计结果显示,所有群体均为幼虫数量最多,雌雄比接近1∶1。C基因型群体SXP1、DXP2和HLJP1与B基因型群体TCC1致病级数无显著性差异,与基因型L和H具有显著差异。

图2 不同来源腐烂茎线虫侵染马铃薯症状Fig.2 Symptoms of potato infected with D.destructor from different sources

对马铃薯不同部位线虫统计结果显示,腐烂茎线虫主要集中分布于块茎。削皮后发现马铃薯薯皮和薯肉中线虫数量均比较低,故未分别统计(表4)。其中,1个马铃薯样品分离得到10条腐烂茎线虫,大部分样品未分离到线虫。地上部和土壤中均未发现腐烂茎线虫。

表4 腐烂茎线虫不同群体对马铃薯侵染情况Table 4 Infection of D.destructor from different sources to potato

接种线虫后,马铃薯地上部、根系和茎基部未见明显症状。块茎表皮有黑褐色斑点,表皮薄纸化易剥离,发病部位薯皮出现裂口。将薯块横切,可见病斑由表皮向内延伸,呈现黑色点状病斑,严重时为黑褐色干腐状,薯块中心无明显症状。

2.4 腐烂茎线虫对马铃薯和甘薯的致病性比较

接种60 d后,对每个处理的线虫数量对比发现(图3),SXP1、DXP2、HLJP1和TCC1等4个群体对甘薯和马铃薯均具有致病力,HLJP1在马铃薯上的繁殖数量大于甘薯,而其他群体在甘薯上的繁殖数量均高于马铃薯。甘薯上4个群体繁殖数量依次为SXP1＞HLJP1＞DXP2＞TCC1;马铃薯上6个群体繁殖数量依次为HLJP1＞DXP2＞SXP1＞WYA3＞TCC1＞HZA3。结合致病力结果(表2,表3)发现,线虫繁殖系数与其致病力大小总体呈正相关,即繁殖系数越大致病力越强。HLJP1在甘薯上繁殖数略大于DXP2,但致病力DXP2大于HLJP1。

图3 不同来源茎线虫在甘薯和马铃薯繁殖数量上的对比Fig.3 Comparison of number of D.destructor isolated from different sources in sweet potato and potato

3 结论与讨论

本研究对不同腐烂茎线虫群体进行致病性测定。结果表明,3个不同地理来源的马铃薯C基因型群体对甘薯和马铃薯均具有较强致病性;党参B基因型群体对甘薯致病力较弱,对马铃薯致病力极低;当归L、H基因型群也可侵染马铃薯,但致病力较低,所有群体均未能侵染党参。表明不同基因型、寄主来源和地理来源腐烂茎线虫致病性均存在差异。

关于不同来源腐烂茎线虫致病性差异的研究,主要集中于不同地理来源和基因型群体致病性差异分析。王宏宝[24]发现不同地域的10个甘薯腐烂茎线虫群体对于甘薯块根(‘苏薯9号’‘宁薯9号’)的致病性,可以划分为3个不同强度的致病类群。程云等[27]发现甘薯线虫群体对于不同品种的花生致病力存在差异,证实在中国甘薯上的腐烂茎线虫可以侵染花生。王宏宝等[21]发现不同基因类型(A、B型)群体在甘薯不同品种上雌雄比和繁殖数量存在差异。Macguidwin[28]发现腐烂茎线虫对蚕豆致病性较强,红三叶和玉米致病性次之,对苜蓿致病性较差,对洋葱无侵染性。章淑玲[11]将来源于甘薯的腐烂茎线虫接种于15种植物,发现腐烂茎线虫可以侵染甘薯、白萝卜、胡萝卜、马铃薯、大蒜、花生和雍菜,且对甘薯的致病性强于马铃薯。本研究发现不同寄主、地理和基因型来源的6个腐烂茎线虫群体,对甘薯和马铃薯的致病性存在差异,甘薯为腐烂茎线虫良好寄主,马铃薯为中等寄主,此结果与其他相关报道相近。

Ni等[10]首次发现腐烂茎线虫可以侵染党参,田间调查发现该病发生较轻,盆栽接种5 000条/盆时,该线虫可以侵染党参。本研究中接种500条/盆时,所有群体均未侵染党参,推测可能和党参品种、接种数量有关,或者党参不是腐烂茎线虫的良好寄主。

腐烂茎线虫种内分化严重,其致病性[11]、生物学特性[21]和抗药性[29]等方面均存在差异。本研究发现,来源于党参、当归和马铃薯的4类基因型腐烂茎线虫群体致病性存在分化,对甘薯具有较强致病性,对马铃薯和党参侵染力较低,由于条件限制,尚未测定对当归的致病性。甘肃省是马铃薯和中药材种植大省,每年有大量马铃薯种薯和药材种苗销往各地,这将有利于腐烂茎线虫的传播蔓延,故应该加强腐烂茎线虫的检疫措施,降低该线虫传播和危害的风险。