李春梅 岳 宁 李敏洁 王 琦 李晓慧 金 芬,*

(1 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京 100081；2 中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193)

初级芳香胺类化合物是指苯胺分子中的氢原子被其他功能基团取代后形成的一类化合物，是一种重要的化工原料和中间体，广泛应用于食品接触材料、染料以及纺织品、农药及杀虫剂、日化产品、橡胶等生产中[1-2]。然而，初级芳香胺的大量使用导致其在食品接触材料[2]、环境[3-4]，甚至人体中[5]广泛分布，其中食品接触材料中残留的芳香胺化合物会进一步向食品迁移，对食品安全[6-7]和人体健康[8-10]造成一定威胁。已有研究表明，初级芳香胺类化合物进入人体后会损害中枢神经和心血管系统，部分化合物还具有致癌作用[11-12]。国际癌症研究机构已将部分芳香胺归类为“致癌物”或“可能的致癌物”[13]。因此，对初级芳香胺类化合物的快速鉴定和分析具有重要的现实意义。

目前，关于初级芳香胺检测方法的研究较多，但主要集中于定量检测方法的建立，包括毛细管电泳法[14-15]、气相色谱法[16]、液相色谱法[17-18]、质谱联用法[1,10,19-24]等，而对初级芳香胺质谱裂解规律的研究甚少。张小平等[25]采用电喷雾萃取电离-串联质谱技术研究了3种N, N-二乙基苯胺类化合物的碎裂行为，然而线性离子阱质谱分辨率相对较低，不能直观地给出各离子的高精度质量数和碎裂片段元素组成信息，对裂解途径的判断证据不足，进一步采用同位素标记试验对其碎裂行为进行了验证。超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法(ultra-performance liquid chromatography coupled to quadrupole orbitrap high-resolution mass spectrometry, UPLC-Q-Orbitrap HRMS)是近几年发展起来的一种新型液质联用技术，具有质量精度好、定性和定量能力强等特点，已广泛应用于农产品及环境中有毒有害物质[26-28]和天然产物[29-31]的质谱裂解规律研究。因此，本研究拟采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS技术对14种初级芳香胺类化合物的主要特征碎片离子进行分析，发现并归纳其基本裂解途径，以期为实现复杂基质中芳香胺类化合物的快速准确鉴定提供质谱依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

邻甲苯胺、2, 4-二甲基苯胺、2, 6-二甲基苯胺、2, 4, 5-三甲基苯胺、对氯苯胺、4-氯邻甲苯胺、2-甲氧基苯胺、3-甲基-6-甲氧基苯胺、联苯胺、4-氨基联苯、3, 3′-二甲基联苯胺、3, 3′-二甲氧基联苯胺、4-氨基偶氮苯、邻氨基偶氮甲苯标准品(纯度>98%)，德国Dr. Ehrenstorfer公司；甲醇、甲酸(色谱纯)，美国Thermo Fisher公司；超纯水由Milli-R04纯水仪(德国Millipore公司)制得。

初级芳香胺类标准溶液采用甲醇溶解，使用时用甲醇配制成200 μg·L-1的工作溶液。

1.2 仪器与设备

Dionex Ultimate 3000超高效液相色谱仪，美国Dionex公司；Thermo Q-Exactive Orbitrap超高分辨质谱仪，美国Thermo Fisher公司，配加热电喷雾电离源。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件 色谱柱：Thermo Hypersil GOLD aQ柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；流动相：A为甲醇，B为0.1%甲酸水溶液；洗脱程序：0～10 min(5%～40% A)，10～18 min(40%～100% A)，18～22 min(100% A)，22～22.1 min(100%～5% A)，22.1～25 min(5% A)；流速：0.3 mL·min-1；柱温：40℃；进样体积：5 μL。

1.3.2 质谱条件 正离子扫描模式，采集模式为全扫描/数据依赖性二级扫描(Full MS/dd-MS2)，质量扫描范围m/z 100～1 500，一级分辨率70 000，二级分辨率17 500，自动增益控制进入轨道阱中的离子数(AGC target)为1.0×e6，最大注入时间为100 ms。归一化碰撞能量(normalized collision energies，NCE)设定为20%、30%和40%，喷雾电压设定为3.6 kV，毛细管温度为350℃，辅助气体加热器温度为300℃。

2 结果与分析

2.1 正离子模式下初级芳香胺的UPLC-Q-Orbitrap HRMS分析

本研究采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS技术对14种初级芳香胺类化合物进行分析，其化学结构见图1。从结构上看，该类化合物是苯胺分子中的氢原子被甲基、氯原子、甲氧基、苯基或苯偶氮基等不同基团取代后形成的一类化合物。由于初级芳香胺类化合物中的氮原子含有孤对电子，容易缔合质子，形成稳定的质子化离子[M+H]+，因此，选择电喷雾正离子模式进行质谱分析。14种初级芳香胺的最佳电离方式、分子离子峰存在形式、基峰m/z值如表1所示。

2.2 初级芳香胺的质谱裂解规律分析

正离子模式下，14种初级芳香胺类化合物在一级质谱中均可产生较强的准分子离子[M+H]+，由苯胺分子上的氮原子质子化后形成。14种初级芳香胺类化合物的母离子及主要碎片离子数据见表1。

表1 14种初级芳香胺的最佳电离方式、分子离子峰存在形式、基峰值和主要碎片离子Table 1 The best ionization mode, molecular ion peak, base peak value and the major fragment ions of the 14 primary aromatic amines

2.2.1 甲基取代苯胺类化合物 邻甲苯胺、2, 4-二甲基苯胺、2, 6-二甲基苯胺和2, 4, 5-三甲基苯胺4种初级芳香胺类化合物均由不同数量的甲基取代苯胺中的氢原子产生，二级质谱中可以产生丰度较大的脱NH3碎片(图2)。因此，这4种初级芳香胺类物质的特征碎片离子主要为中性丢失NH3的离子，其中1个甲基取代的苯胺类化合物邻甲苯胺在正离子模式下的分子离子峰[M+H]+为m/z108.080 90，中性丢失NH3形成特征碎片离子[C7H7]+m/z91.054 57。2个甲基取代的苯胺类化合物2, 4-二甲基苯胺、2, 6-二甲基苯胺为同分异构体，中性丢失NH3形成的碎片离子均为[C8H9]+m/z105.070 11。3个甲基取代的苯胺类化合物2, 4, 5-三甲基苯胺分子离子峰[M+H]+为m/z136.111 89，中性丢失NH3形成特征碎片离子[C9H11]+m/z119.085 33。

图2 邻甲苯胺、2, 4-二甲基苯胺、2, 6-二甲基苯胺和2, 4, 5-三甲基苯胺的二级质谱图Fig.2 MS/MS spectrum of o-toluidine, 2, 4-xylidine, 2, 6-xylidine and 2, 4, 5-trimethylaniline

2.2.2 氯代苯胺类化合物 氯代苯胺类化合物对氯苯胺和4-氯邻甲苯胺均为苯胺分子中的氢原子被氯取代，与上述4种甲基取代的苯胺类化合物类似，二级质谱中亦产生丰度较大的脱NH3碎片，并在此基础上进一步丢失氯原子(图3)。因此，这2种初级芳香胺类物质的特征碎片离子主要为中性丢失NH3的离子，以及丢失NH3和氯原子的碎片离子。以4-氯邻甲苯胺为例，在正离子模式下的分子离子峰[M+H]+为m/z142.040 04，中性丢失NH3形成特征碎片离子[C7H6Cl]+m/z125.015 26，在此基础上发生碳正离子重排后，丢失氯原子形成碎片离子[·C7H6]+m/z90.048 10，其可能的裂解途径如图4所示。

图3 对氯苯胺和4-氯邻甲苯胺的二级质谱图Fig.3 MS/MS spectrum of p-chloroaniline and 4-chloro-o-toluidine

图4 正离子模式下4-氯邻甲苯胺可能的裂解途径Fig.4 The proposed fragmentation pathways of 4-chloro-o-toluidine in positive ion mode

2.2.3 甲氧基取代苯胺类化合物 甲氧基取代苯胺类化合物2-甲氧基苯胺和3-甲基-6-甲氧基苯胺均为苯胺分子中的氢原子被甲氧基取代，与上述甲基、氯取代的苯胺类化合物类似，二级质谱中亦产生丰度较大的脱NH3碎片，同时还可丢失CH3O基团(图5)。因此，这2种初级芳香胺类物质的特征碎片离子主要为中性丢失NH3和CH3O的碎片离子。以3-甲基-6-甲氧基苯胺为例，在正离子模式下的分子离子峰[M+H]+为m/z138.091 13，中性丢失NH3形成特征碎片离子[C8H9O]+m/z121.088 82，在此基础上丢失CH3O基团形成碎片离子[C7H7]+m/z91.054 70。此外，3-甲基-6-甲氧基苯胺在苯胺分子上还有甲基取代，因此，在中性丢失NH3后碳正离子转移重排到苯甲基上，丢失CH3形成碎片离子[C7H7O]+m/z107.049 20，进一步脱去CH3O基团形成[C6H5]+m/z77.039 17碎片离子。另外，正离子模式下，3-甲基-6-甲氧基苯胺上的甲氧基亦可质子化，然后直接中性丢失CH3O形成特征碎片离子[C7H8N]+m/z106.065 38， 其可能的裂解途径如图6所示。

图5 2-甲氧基苯胺和3-甲基-6-甲氧基苯胺的二级质谱图Fig.5 MS/MS spectrum of 2-methoxyaniline and 3-methyl-6-methoxyaniline

图6 正离子模式下3-甲基-6-甲氧基苯胺可能的裂解途径Fig.6 The proposed fragmentation pathways of 3-methyl-6-methoxyaniline in positive ion mode

2.2.4 联苯胺类化合物 联苯胺、4-氨基联苯、3, 3′-二甲基联苯胺、3, 3′-二甲氧基联苯胺均属于联苯胺类化合物，与其他芳香胺类物质类似，联苯胺类物质二级质谱中亦可产生脱NH3碎片(图7)。此外，3, 3′-二甲基联苯胺、3, 3′-二甲氧基联苯胺还会先发生CN键断裂，分别产生碎片[C14H16N]+m/z198.127 65、[C14H16NO2]+m/z230.104 60，继而中性丢失NH3形成[C14H13]+m/z181.088 30、[C14H13O2]+m/z213.102 05特征碎片离子，其中3, 3′-二甲基联苯胺可能的裂解途径如图8所示。

图7 联苯胺、4-氨基联苯、3, 3′-二甲基联苯胺、3, 3′-二甲氧基联苯胺的二级质谱图Fig.7 MS/MS spectrum of benzidine, 4-aminobiphenyl, 3, 3′-dimethylbenzidine and 3, 3′-dimethoxybenzidine

图8 正离子模式下3, 3′-二甲基联苯胺可能的裂解途径Fig.8 The proposed fragmentation pathways of 3, 3′-dimethylbenzidine in positive ion mode

2.2.5 偶氮苯类化合物 4-氨基偶氮苯、邻氨基偶氮甲苯均属于偶氮苯类化合物，在正离子模式下的二级全扫描质谱图如图9所示。两种化合物二级质谱亦可发生NH3中性碎片的丢失，分别形成特征碎片离子[C12H9N2]+m/z181.077 70、[C14H13N2]+m/z209.164 58。除此之外，以邻氨基偶氮甲苯为例，由于高键能的偶氮键(—N=N—)不易发生断裂，裂解过程在近苯环端的CN键还发生断裂，形成[·C7H7N3]+m/z133.075 91、[C7H7]+m/z91.054 65碎片离子，以及在近苯胺端的CN键断裂，形成[C7H8N]+m/z106.065 12碎片离子，其裂解途径如图10所示。

图9 4-氨基偶氮苯、邻氨基偶氮甲苯的二级质谱图Fig.9 MS/MS spectrum of 4-phenyldiazenylaniline and o-aminoazotoluene

图10 正离子模式下邻氨基偶氮甲苯可能的裂解途径Fig.10 The proposed fragmentation pathways of o-aminoazotoluene in positive ion mode

3 讨论

有毒有害物质在食品和环境中的残留直接危害人体健康，而有毒有害物质涉及面广，涵盖的种类复杂。因此，通过研究不同结构类型化合物在质谱中的电离和裂解，总结该类化合物在质谱中的裂解规律，如中性丢失或电离产生特征性离子碎片等，对同类结构污染物的快速鉴定分析具有重要的参考和指导作用。UPLC-Q-Orbitrap HRMS是近年研究热点，该技术具有高分辨率、高质量精度优势，已用于农产品及环境中有毒有害物质谱碎裂途径的研究[26-28,32]，但是该技术用于初级芳香胺类化合物裂解途径的研究鲜有报道，主要集中于部分初级芳香胺的靶向定量检测方法建立[22,33-34]，如Sanchis等[22]建立了食品接触材料中8种初级芳香胺的UPLC-Q-Orbitrap HRMS分析方法，并采用靶向和后靶向分析法对实际食品接触材料样品中的初级芳香胺进行分析。本研究采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS技术对14种初级芳香胺化合物进行分析，可以获得各碎片离子的精确质量数，质荷比精确至小数点后5位，极大提高了定性的准确度。通过对初级芳香胺化合物分子离子峰的存在形式及可能的裂解规律进行分析，发现此类化合物更易形成[M+H]+，继而丢失中性碎片NH3，在此基础上，氯代苯胺类化合物发生碳正离子重排后丢失氯原子，甲氧基取代苯胺类化合物丢失CH3O基团或者CH3，所得碎片离子与Perez等[20]的结果相似。此外，甲基或甲氧基取代的联苯胺类化合物还会发生CN键断裂，继而中性丢失NH3碎片，偶氮苯类化合物由于高键能的偶氮键不易发生断裂，碎片离子主要通过两侧的CN键断裂形成，该结果与具有2个偶氮基团的苏丹红IV裂解规律相似[27]。对于初级芳香胺类化合物，HPLC-Q-Orbitrap HRMS可根据现有的初级芳香胺裂解规律来推断其结构，充分发挥其高分辨、快速分析的优势，为初级芳香胺类化合物的快速鉴定提供理论基础。

4 结论

本试验采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS技术研究了14种初级芳香胺类化合物在电喷雾正离子模式下的质谱裂解行为，发现此类化合物均丢失中性碎片NH3，在此基础上，氯代和甲氧基取代苯胺类化合物分别丢失取代基团氯原子和CH3O或CH3基团，甲基或甲氧基取代的联苯胺类和偶氮苯类化合物还会发生CN键断裂，形成碎片离子，这些质谱裂解规律可为具有相似结构特征的初级芳香胺类化合物结构解析提供重要依据，同时为使用质谱技术对样品中未知初级芳香胺类的非靶向快速筛查提供理论基础。