宋丽娜 王晓敏,2,3,4,* 刘文娟 杨 宏 付金军 胡新华 高艳明,2,3,4 李建设,2,3,4

(1 宁夏大学农学院，宁夏 银川 750021；2 宁夏现代设施园艺工程技术研究中心，宁夏 银川 750021；3 宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室，宁夏 银川 750021；4 宁夏设施园艺(宁夏大学)技术创新中心，宁夏 银川 750021；5 宁夏巨丰种苗有限责任公司，宁夏，银川 750021)

番茄(Solanumlycopersicom)，原产于南美洲，属于茄科草本植物[1]。番茄果实富含多种营养元素，具有抗氧化能力，能够预防多种疾病[2]。截止2020年，我国番茄的年产量已达6 515万吨，种植面积达百万公顷，目前我国已成为世界上最大的番茄生产国[3]。宁夏地处黄河中上游的气候干爽，日照充足，为本地番茄栽培创造了有利的环境条件，尤其在全国大部分地区遇到持续高温天气时，宁夏地区因气候冷凉、昼夜温差大，种植的番茄果实品质佳，使得该地区成为我国越夏番茄的新产区[3]。番茄作为宁夏重要农产品之一，种质资源数量庞大，因此，开展番茄种质资源的遗传多样性相关研究，对番茄品种改良和杂种优势利用，了解物种起源、预测物种适应性、预测遗传资源分布、开发与利用种质资源等具有重要意义[4-5]。

迄今为止，已有前人开展了关于番茄种质遗传多样性的研究，但是对于种质资源遗传多样性的评价主要依赖于表型。例如何润铭等[6]对95份番茄种质资源的23个表型进行了遗传多样性分析，发现当前番茄育种在一定程度上趋于同质化，应该重视对不同遗传背景材料的保护；李艳红等[7]利用表型性状对华南地区的樱桃番茄的种质资源进行评价，结果表明，数量性状在不同类型番茄的种质个体间差异较大，供试材料的表型遗传变异丰富。由于不同材料对蕃茄种质的多样性影响有差异，且表型性状易受基因型和环境条件的影响，分子标记的发展为作物遗传多样性分析提供了更有力、更精准的工具[8]。目前，已有多种分子标记检测方法被开发并应用于番茄育种及遗传多样性分析，包括随机扩增多态性DNA标记(random amplified polymorphic DNA, RAPD)、简单重复序列区间(inter-simple sequence repeat，ISSR)、限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphisms，RFLP)、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)、简单重复序列(simple sequence repeat，SSR)等。宋建等[9]利用400对SSR标记分析了国内外具有代表性的几大类番茄材料，结果表明，番茄材料间存在不同程度的遗传分化，栽培番茄种内亲缘关系相对野生种种间亲缘关系较近，遗传背景十分狭窄，充分反映了我国栽培各类番茄的实际情况。SNP由于具有遗传稳定性和通量高、成本低等优点[10]，已被广泛用于国内外番茄种质资源的遗传多样性分析[11]。Sim等[12]利用从整个基因组挖掘出的7 720个SNP标记对收集到的426份番茄遗传资源进行基因分型，将其划分为7个不同的番茄类型。冯晶晶等[13]利用59个高质量SNP标记、竞争性等位基因特异性PCR(kompetitive allele specific PCR，KASP)技术对收集到的来源广泛的433份醋栗番茄种质资源进行遗传多样性分析，结果表明，醋栗番茄能够为栽培番茄提供遗传变异资源库。从2015年开始至今，宁夏的蕃茄育种在种质资源遗传多样性方面开展了一些研究工作[14-16]，但是基于分子标记尤其是SNP标记对番茄种质资源遗传多样性的研究还处于初步发展阶段。

鉴于此，本研究以60对SNP引物对来自不同地区504份番茄种质资源的遗传多样性、聚类分析、主成分分析及群体遗传结构进行研究，以期揭示不同材料在DNA水平上的遗传变异，为提高宁夏地区种质资源的利用效率及核心种质构建提供理论依据和材料基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用504份番茄种质资源由宁夏大学农学院蔬菜课题组(本课题组)和宁夏巨丰种苗有限公司共同提供，编号为S001～S504，详细信息见电子附表1。

1.2 试验方法

1.2.1 番茄叶片基因组DNA的提取与检测 参照芮文婧[17]的方法，采用十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium，CTAB)法提取番茄叶片基因组DNA。

1.2.2 引物筛选与PCR扩增反应 本研究利用宁夏大学瓜菜遗传育种实验室筛选的均匀覆盖12条染色体的60对引物(电子附表2)对504份番茄种质资源进行遗传多样性分析，PCR扩增反应总体系为5 μL：20～50 ng·μL-1DNA模板2.20 μL、KASP Master Mix 2.50 μL、KBD Assay mix 0.07 μL、ddH2O 0.23 μL。PCR反应程序：95℃预变性15 min；95℃变性20 s，55～61℃延伸60 s，每循环退火延伸温度为0.6℃，10个循环；95℃变性20 s，57℃延伸60 s，32个循环。设置4个空白对照，模板用ddH2O代替。PCR反应在Pro-flexTMPCR扩增仪(ABI美国)上进行，在Omega F SNP荧光检测仪(LGC，英国)读取数据，结果利用软件Kluster Caller获得待测样品的SNP位点的数据。

1.3 数据分析

根据SNP分型结果，利用PowerMarker软件计算各材料间的遗传距离，在此基础上采用加权平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)构建聚类图，使用MEGA 5.0软件绘制聚类图；并计算每个SNP位点的等位变异数、等位基因频率、基因多样性、杂合率、多态性信息含量(polymorphism information content，PIC)。利用Structure 2.3.4软件分析群体遗传结构，估算最佳群体组群数K，并计算Q值。利用GenALex 6.5软件进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 番茄种质资源遗传多样性分析

利用60对SNP标记对504份番茄材料的遗传多样性进行分析(表1)，结果表明，60对SNP引物共检测到181个等位基因，平均每个位点有3个等位基因，NDP7582、NDP7560、NDP7783检测到的等位基因数最多，为4个；60个SNP标记的主要等位基因频率(major allele frequency, MAF)平均值为0.659，变幅为0.375～0.905，其中NDP7560最高，NDP7781最低；期望杂合率(Heterozygosity)平均值为0.069；基因多样性在0.178～0.658之间，平均值为0.450，其中DNP7781的基因多样性最高，NDP7560的基因多样性最低，基因多样性在0.600以上的有NDP7723(0.625)、NDP7529(0.623)、NDP7625(0.652)、DNP7596(0.643)、DNP7661(0.612)、DNP7781(0.658)，表明番茄种质资源有一定的多样性。

表1 60个SNP位点的多态性分析Table 1 Genetic diversity analysis of 60 SNP loci

表1(续)

由表1可知，多态性信息值(PIC)变幅为0.171～0.583，平均值为0.381，PIC在0.5以上的有NDP7723(0.554)、NDP7589(0.501)、NDP7529(0.551)、NDP7710(0.508)、DNP7625(0.577)、NDP7596(0.569)、DNP7661(0.537)、NDP7368(0.512)、DNP7781(0.583)，共9个SNP标记。Botstein等[18]指出当PIC值>0.5时，表明其具有高度多态性；当0.25

图1 SNP标记多态性信息值(PIC)柱形图Fig.1 Histogram of SNP marker polymorphism information value (PIC)

2.2 番茄种质资源的聚类分析与主成分分析

基于遗传距离构建504份番茄种质资源的UPGMA聚类图，结果如图2所示。504份番茄种质资源的遗传距离范围在0.02～2.64之间，平均遗传距离为0.62，在遗传距离为0.36时被分为7类。

图2 基于SNP标记的504份番茄种质资源聚类图Fig.2 Cluster map of 504 tomato germplasm resources based on SNP marker

第Ⅰ类包含S460和S458共2份材料，均为来自甘肃的红果樱桃番茄，植株长势中等，早熟；S458的生长习性为有限生长型，果形为椭圆，果实较硬；S460的生长习性为无限生长型，果形为圆形，果实较软。

第Ⅱ类包含120份材料，其中来自宁夏27份，甘肃73份，四川和云南各3份，辽宁10份，陕西4份；这一类群的材料中有15份材料为樱桃番茄，其余均为大果番茄；大多数材料为无限生长型、生长势较强的中晚熟番茄，果形主要为圆形，成熟果色有红色、粉色和黄色三类。

第Ⅲ类包含8份材料，其中S055来自甘肃，其余均来自宁夏；S055、S056、S057材料为樱桃番茄，S058、 S059、 S060、 S061和S062材料为口感型的大果番茄，这8份材料均为植株长势强的无限生长类型早熟番茄，果形有圆形和扁圆形，果实较软，成熟果色有粉色和紫色。

第Ⅳ类别包含72份材料，均为樱桃番茄，其中来自甘肃24份，宁夏43份，陕西5份；这一类群材料主要为无限生长型、生长势较强的早熟和中早熟番茄，果形主要为长圆形，果实较硬，成熟果色有红、粉、黄色三类。

第Ⅴ类和第Ⅵ类均包含2份材料，其中第Ⅴ类番茄S064和S179来自甘肃，均为无限生长型、生长势强的早熟番茄品种，果形为圆形，果实较软；S064成熟果色为粉色，S179成熟果色为红色。第Ⅵ类2份番茄材料来自宁夏，均为长势强的无限生长型早熟红果番茄，果形为圆形，果实较硬。

第Ⅶ类包含298份材料，其中来自宁夏118份、甘肃144份、四川8份、辽宁10份、陕西14份和山东5份；这类材料大多数为无限生长型、生长势较强的早熟大果番茄，果形主要是圆形和扁圆形，成熟果色有红色和粉色。

第Ⅱ类的甘肃粉果材料S435与第Ⅶ类的辽宁红果材料S372间的遗传距离最大，为2.64，说明这两个材料之间的亲缘关系较远，遗传背景复杂且遗传多样性较高；第Ⅶ类S212与S214材料间遗传距离最小，为0.02，二者均来源于甘肃地区且果实不容易转色，说明这两个材料之间亲缘关系较近。

由主成分分析二维图可知(图3)，第1主成分与第2主成分的贡献率分别为11.4%和10.01%。二维图中的位置距离能够直观地代表番茄种质资源的亲缘关系的远近，group1与group2主要分布在第1、第2、第4象限，且两个群体之间有重叠现象，group3集中分布在第2、第3象限，且与其他群体之间基本没有重叠，证明group3包含的材料与其他两组的亲缘关系较远。

图3 基于SNP标记的504个番茄种质资源主成分分析二维图Fig.3 Two-dimensional map of principal component analysis of 504 tomato germplasm based on SNP markers

2.3 群体遗传结构分析

基于SNP分子标记数据，运用Structure 2.3.4软件对504份番茄种质资源进行群体遗传结构分析，将分析得到的dimensional K绘制折线图(图4)，结果表明在K=3时，ΔK达到最大值。因此，将504份番茄种质资源划分为3个类群(图5)，第一个群体(红色)包含79份材料，第二个群体(绿色)包含302份材料，第三个群体(蓝色)包含123份材料。参考Evanno等[19]研究发现，当Q>0.6时，则表示该材料遗传背景简单，反之则表示遗传背景复杂。从各类群的Q值分布表发现(表2)，95.44%的番茄Q值大于等于0.6，有70.24%的番茄Q值≥0.9，表明大多数参试材料的遗传背景简单，大数为纯合或者高代材料；4.56%的参试材料的Q值小于0.6，表明这23份番茄种质资源可能为杂合材料。

图4 K值与ΔK的变化折线图Fig.4 The change of K value and ΔK line diagram

表2 各类群Q值分布Table 2 Q value distribution of various groups

3 讨论

优异的种质资源是新品种的选育基础，种质资源遗传多样性评价与鉴定是挖掘优良育种材料、提高育种效率的有效工具[20]。分子标记技术是鉴定和评价番茄种质资源遗传多样性的有效手段。邓学斌等[21]利用46对SNP标记对收集的不同类型的加工番茄种质资源进行遗传多样性评价，发现3 026份资源的期望杂合度均值为0.435，平均PIC为0.338。刘希艳等[22]利用44对SNP标记对615份番茄材料进行研究，表明番茄材料的基因多样性均值为0.470，平均PIC为0.392 1；王涛等[20]利用筛选的103对SNP标记对210份番茄资源进行基因分型，结果表明平均期望杂合度为0.029，基因多样性均值为0.346，平均PIC为0.308。在本研究中，利用筛选的60对SNP分子标记运用KASP技术对收集的504份番茄种质资源进行了遗传多样性分析，共检测到181个等位基因，期望杂合度均值为0.069，基因多样性均值为0.450，平均PIC为0.381。比较发现，本研究收集的番茄种质资源的期望杂合度(0.069)与王涛等[20]的研究结果基本一致(0.029)，远低于邓学斌等[21]的研究结果(0.435)，原因可能是本研究参试的番茄材料多数为高代或纯合材料，杂合率较低，这与群体遗传结构分析结果基本相同，邓学斌等[21]利用的番茄材料全部为单株多代自交材料，而非高代或纯合材料，因此期望杂合度较高。基因多样性的大小(0.450)与刘希艳等[22]的研究结果(0.470)相当，高于王涛等[20]的研究结果(0.389)，可能的原因是本研究的试材数量较多，种类多样，而王涛等[20]的参试材料主要为鲜食番茄，类型较少。本研究筛选的60对SNP标记的PIC平均值较高(0.381)，表明本研究筛选的SNP分子标记表现为中度偏高的多态性，这些SNP标记可以用于番茄种质资源的遗传多样性分析和后期其他遗传关系的研究。

根据聚类分析结果将504份番茄材料分为7类，第Ⅰ类材料均为植株长势中等、早熟的红果樱桃番茄，可用于早熟红果樱桃番茄的培育；第Ⅱ类材料大多数为植株长势较强、无限生长的中晚熟番茄，果色丰富，遗传潜力较大，可用于培育各类型中晚熟大果或樱桃番茄品种，满足周年生产的需求；第Ⅲ类材料均为植株长势强、无限生长型的早熟番茄，包括5份口感型大果番茄材料和2份紫色樱桃番茄材料，因此，这类材料可用于培育口感型粉色大果或紫色樱桃番茄等特色品种；第Ⅳ类材料均为果实较硬、果色丰富、早熟的长圆形樱桃番茄，这类材料可用于培育耐贮运的长圆形樱桃番茄品种；第Ⅴ、第Ⅵ和第Ⅶ类材料多数为生长势强、无限生长型的圆形或扁圆形的大果早熟番茄，可用于培育早熟大果鲜食番茄品种。遗传距离可判断作物种质资源的亲缘关系，遗传距离越大亲缘关系越远，反之亦然。本研究的504份参试材料有490份材料均集中在第Ⅱ、第Ⅳ、第Ⅶ类；材料间的遗传距离的变化范围0.02～2.64，平均值为0.62，说明本研究参试材料的具有一定遗传差异和遗传多样性，但丰富性仍不高，可能的原因是供试材料均为地方选育的栽培种。Sacco等[23]和Sim等[24]的研究结果表明，地方栽培品种的遗传变异水平较低，推测是由于育种者通常从最好的果实中收集种子，而不是收集更优异的基因型[25]。因此，种质资源的收集至关重要。本课题组已经开始了对国外番茄种质的收集，包括野生种质与栽培品种，以此丰富本课题组的番茄种质资源。

主成分分析与群体结构分析均划分为三类，与聚类分析划分类群数不同，类群Ⅳ与group1和群体Ⅰ、类群Ⅶ与group2和群体Ⅱ、类群Ⅱ与group3和群体Ⅲ包含的番茄材料基本一致。从三种不同的聚类方法能够发现参试的504份种质资源的聚类结果与地理来源没有明显的关系，原因在于：一方面可能是种质资源的遗传背景不够明确，无法细分，番茄种质通过自交，导致种内出现基因交流，从群体结构也可发现种群内存在基因交流现象；另一方面可能是引物数量较少，检测位点未能覆盖所有变异，这与周艳朝等[26]和胡永超等[27]的推断一致。

4 结论

本研究利用60对SNP引物，对收集的504份番茄种质资源进行遗传多样性分析，结果表明，每个SNP标记平均有3个等位基因，多态性信息值(PIC)平均值为0.381；同时发现有NDP7723(0.554)、NDP7589(0.501)、NDP7529(0.551)、NDP7710(0.508)、DNP7625(0.577)、NDP7596(0.569)、DNP7661(0.537)、NDP7368(0.512)、DNP7781(0.583)共9个具有高度多态性较高的SNP标记。基于SNP标记对参试材料进行UPGMA聚类分析、主成分分析和群体遗传结构分析，了解到番茄种质资源之间存在一定的亲缘关系，反映了不同番茄材料之间存在基因交流。