董桃杏,张国森,杨 劭 (1.华中师范大学生命科学学院,湖北 武汉 40079；2.湖北第二师范学院化学与生命科学学院,湖北 武汉 40205；.河南大学基础医学院,河南 开封 475004)

双酚 A(BPA)是一种重要的有机化工原料,被用于多种精细化工产品[1-2].BPA具有雌激素活性,对生物和人体细胞具有生物学毒性,是一种典型的环境激素类污染物[3].在BPA的生产、加工和使用过程中,大量的 BPA 被释放到环境中,随地表径流输入,导致水体成为BPA的主要蓄积库.据报道BPA 在世界上很多水环境中都有发现,被检测出来的浓度范围0.33～900ng/L[4-8].水环境中BPA产生的人类健康和生态风险已经引起广泛关注[9-13],并成为欧盟水框架指令中首要控制的污染物之一[14].

生物降解是水环境 BPA 消除的主要途径.许多微生物能够利用环境中天然的芳香族化合物作为底物,从而高效降解BPA.Oshiman等[15]从受污染的土壤中筛选到的 Sphingomonas bisphenolicum strain AO1 能够以 BPA为唯一碳源和能源迅速矿化 BPA.真菌类比如木质素真菌(Lignolitic fungi)也具有高效降解 BPA的能力,并且其降解产物完全没有雌激素活性[16-17].对生物降解 BPA的机制进行研究发现,POD发挥着重要的作用.据报道真菌中降解BPA的关键酶主要包括木质素过氧化物酶(LiP)、锰过氧化物酶(MnP)以及多功能过氧化物酶(VP)[18].植物POD也在BPA降解过程中扮演着重要角色.如辣根POD可以降解61%的BPA[19].在腐殖酸催化情况下,辣根POD在2min内就将BPA完全降解[20].Reis等[21]也认为POD是水生植物降解BPA的主要酶.

本文前期进行过大量的植物筛选,通过比选常见水生植物如金鱼藻、轮叶黑藻、伊乐藻、狐尾藻等对 BPA的降解能力,发现金鱼藻降解效率最高而富集率最低,分别为98.9%和 0.1%,而其他几种水生植物降解率则为59.2%～90.3%,富集率为0.97%～3.5%[22].另外金鱼藻对BPA的单位降解效率最高可以达到 0.204mg/(g·d),远远高于其他陆生植物和水生植物[23-25].通过相关实验发现H2O2是降解过程的必须条件,推测POD是金鱼藻降解BPA的关键酶[26].由于水生植物是湿地生态系统的主要生物类群,其对污染物的降解在湿地污染生态学中具有重要科学意义.虽然有关陆生植物对 BPA的降解效率和降解酶已有报道,但沉水植物降解 BPA的特性和机制尚无深入研究.因此,本文在前期研究的基础上,选择降解BPA效率最高的金鱼藻,探讨金鱼藻纯化POD的酶学特点以及对 BPA的降解性能,旨在揭示沉水植物高效降解水环境中BPA污染物的机制,及POD在此降解过程中发挥的重要作用,为水环境中 BPA的植物修复提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 实验材料

金鱼藻(Ceratophyllum demersum L.)采自湖北武汉东湖.

受试斑马鱼为成年雄性鱼,购于中科院武汉水生生物研究所,在 50cm×30cm×40cm的水族箱中驯养1个月,每天光照12h,水温为(28±1)℃,每天早晚各喂食1次,驯养结束后选择大小一致的斑马鱼进行实验.

BPA标准品(纯度 97%)购自美国 Acros Organics公司,用色谱级甲醇(TEDIA,美国)配置成20mmol/L的母液待用, 4℃保存.乙腈(色谱纯)购自美国 TEDIA公司.高效液相色谱仪为SHIMADZU LC20AT(日本).

1.2 金鱼藻无菌苗的制备与培养

参照Zhou等[27]的方法,将采集来的野生苗材料消毒预处理后,转入含有1/2MS (pH5.5)培养基的培养瓶中进行培养,待萌发新芽后扩繁培养,取培养 4代后的无菌苗用于实验.

1.3 金鱼藻POD粗酶的提取及酶活力测定

金鱼藻 POD粗酶的提取按照周艳虹等[28]的方法进行改进,具体过程为:称取0.2g 鲜重的金鱼藻无菌苗放入预冷的研钵中,置于冰上,加入3mL预冷的50mmol/L pH 7.8的磷酸盐缓冲液,充分研磨均匀后转入10mL 离心管内,用3mL缓冲液将研钵润洗2次,一并转入离心管内,4℃ 12000r/min离心 10min,上清即为POD粗酶液.

POD活力测定参考Kochba等[29]的做法.具体过程为:100μL粗酶上清液加入到2900μL的反应体系中,每隔20s测定470nm下的OD值,以OD470变化0.01为1个酶活力单位,计算POD活力.反应体系由5μmol/L 愈创木酚,12μmol/L H2O2,200μmol/L pH 6.0磷酸盐缓冲液组成.

酶相对活性测定是以温度30℃,pH 6以及H2O2浓度为1mmol/L条件下酶活为100%,其他处理条件下测定的酶活与之相比计算所得.

1.4 金鱼藻POD的纯化和纯度测定

取粗酶上清,经硫酸铵分级沉淀,取60%～90%沉淀部分,用提取缓冲液溶解后 4℃透析过夜.使用AKTA 蛋白纯化系统(PRIFER100,美国 GE)对透析后的粗酶溶液进行纯化,共 2步纯化.第一步用阴离子交换柱进行纯化,收集280nm波长下的峰,并进行过氧化物酶活测定,同时测定蛋白浓度,计算比酶活力与回收率.第二步用葡聚糖凝胶 G75将上述收集到的具有酶活力的峰进行纯化,收集 280nm波长下的峰,并进行过氧化物酶活测定,将具有过氧化物酶活力的峰进行冷冻干燥浓缩,测定蛋白浓度,计算比酶活力与回收率.将纯化后的蛋白进行 SDS-PAGE和Native-PAGE电泳分析[30].

金鱼藻POD的纯度可用Rz值表示[31]

式中:OD403为血红素辅基的吸光值;OD280为样品中总蛋白吸光值;一般认为Rz＞2时,酶的纯度较高.

1.5 不同理化条件对金鱼藻POD活力的影响

分析不同温度、pH值、H2O2浓度等条件金鱼藻POD活力的影响,反应体系与上述相同.将100μL浓度为50U/mL的纯化POD与反应体系混合均匀,在不同温度、pH值、H2O2浓度条件下处理后测定金鱼藻 POD活力.其中温度梯度为10,20,30,40,50,60,70,80,90℃; pH值梯度为3,4,5,6,7,8,9; H2O2浓度梯度分别为0.2,0.5,1,5,10,20mmol/L.

1.6 金鱼藻POD降解BPA的特性分析

在降解体系中加入各不同处理,混合均匀后置于温度为30°C、光照为50μmol/(m2·s)的条件下进行反应,比较温度对降解率影响的实验则将混合液放在对应温度梯度下.降解体系由浓度为0.02mmol/L的BPA及1mmol/L的H2O2和无菌蒸馏水组成,纯化金鱼藻 POD体积为100μL,总体积为20mL;每个处理设置 3个平行,对照组加入等量酶提取缓冲液代替纯化酶液,每隔15min测定反应体系中BPA的浓度.其中POD浓度处理为5,10,25和50U/mL 4个梯度;另外几个条件实验中 POD浓度均设置为50U/mL,其中 H2O2浓度为0.5,1,5,10,20mmol/L;温度为10,20,30,40,50,60,70,80,90°C;pH值为3,4,5,6,7,8,9.

动力学参数测定:取 50U/mL的纯化金鱼藻POD酶投入到含有4×10-5～0.02mmol/L的BPA反应体系中,每隔15min测定反应体系中BPA的浓度,测定米氏常数 Km和最大反应速度 Vmax并做双倒数图.

1.7 BPA浓度的测定

BPA的浓度采用高效液相色谱法进行测定.培养液中的 BPA浓度测定方法为:先将培养液经过0.22µm 滤膜过滤后用于进样检测.高效液相色谱柱为C18反相柱(250mm×4.6mm×5µm).测定条件为流动相乙腈:超纯水(含0.3%三氟乙酸)=65:35(体积比),检测波长为紫外278nm,流速1mL/min.

1.8 斑马鱼的毒性

通过测定斑马鱼在不同实验条件下驯养后血液中卵黄原蛋白(VTG)含量,来反应金鱼藻 POD 降解BPA后的产物对其毒性影响.共设置3个斑马鱼暴露处理组,A组:终浓度为0.02mmol/L的BPA溶液;B组:经金鱼藻 POD完全降解A组溶液后的产物;C组:等体积甲醇代替 BPA.实验用水为曝气48h后的自来水,总体系为3L,BPA母液用量为3mL.每个处理组6只斑马鱼,每2只斑马鱼的血清混合作为一个平行样,共3个平行.毒性试验持续5d.

斑马鱼血液中卵黄原蛋白(VTG)含量测定:斑马鱼血液采集参考 Babaei等[32]的方法离心取血获得血清.血清中的VTG含量使用斑马鱼卵黄蛋白原ELISA检测试剂盒(南京金益柏)进行测定,具体方法参考使用说明.

1.9 数据分析

分别采用SPSS 16.0和Origin pro 8.0;不同条件处理对POD活性影响及对BPA去除率的差异性比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA,Duncan tests);数据正态分布和均一性检验分别采用Kolmogorov—Smirnov test和 Levene’s test.差异显著表示为P＜0.05.

2 结果与分析

2.1 金鱼藻POD的纯化

由图1可知,在280nm紫外条件下,通过阴离子交换层析共发现2个蛋白峰P1和P2(图1(a)),收集检测后发现P1具有较高的POD酶活力,纯化倍数为5.47倍.将该峰进一步通过葡聚糖凝胶 G-75分离,发现有2个蛋白峰,其中P4具有POD酶活力,即为纯化的金鱼藻 POD(图1(b)),纯化倍数为8.13倍,测定 Rz值为2.88,回收率达到 61.57%(表1).经电泳分析发现只有一条带,证明本纯化方法较为有效.

图1 金鱼藻POD阴离子交换层析和葡聚糖凝胶 G-75过滤结果Fig.1 Ion exchange chromatography and sephadexG-75column gel filtration of POD from C.demersum

2.2 不同条件下金鱼藻POD酶活特性

由图2可见,在10℃时POD相对酶活力为55%,随着温度升高,POD 相对酶活力逐渐增加,40～70℃时,POD的相对酶活力均大于100%(P＜0.05),在70℃时相对酶活力最大,达到117%,说明温度升高显著提高了POD的酶活性,而在80℃时POD的相对酶活力仍有78.52%,表明金鱼藻POD具有较宽温度耐受范围,在较高的温度下仍能保持较高活性(图2(a)).大豆POD被公认为热稳定性远高于辣根POD以及其他类似POD,在70℃时仍可保持较高的活力,85℃下加热40min仍保留50%酶活力[33-35],与大豆POD相比,金鱼藻POD能承受较高温度且保持较高活性,是一种热稳定性非常高的POD.

pH值对POD相对酶活性的影响也具有与温度相似趋势.在pH值为3时,POD相对酶活力较低,为36.1%,pH值在 5～7之间具有较高的相对酶活力,而其最适合的 pH值为5,POD相对酶活性最高,为107.5%,当pH值增至8时,该酶相对活力仍然维持在52.7%,表明金鱼藻 POD具有较高的酸碱稳定性(图2(b)).金鱼藻POD在pH值为5～7时具有较高相对活性,这一特性与大多数POD相似,如纯化后的银杏叶POD最适pH值为5[36],菠萝蜜POD最适pH值则为6.5[37].

H2O2浓度方面,随着H2O2浓度的升高,POD的相对酶活力呈升高后降低的趋势,在 H2O2浓度为0.2mmol/L时,POD的相对酶活力仅为36.5%,当H2O2浓度增加至 5mmol/L时,POD的相对酶活力最高(P＜0.05),达119.22%,随后POD相对酶活力逐渐下降(图2(c)).H2O2是POD酶的底物之一,本研究中发现其最适浓度为5mmol/L.H2O2过量并不会提高酶活性,可能是因为生成更多的中间产物,从而对酶活性产生抑制作用,或者是过量的H2O2直接导致酶失活[38].

图2 不同条件对金鱼藻POD酶活力的影响Fig.2 Effect of different conditions on the activity of POD from C.demersum

2.3 金鱼藻POD降解BPA的特性

通过比较不同金鱼藻POD活性下BPA降解率(图3(a)),发现随着POD酶活性的增加,BPA降解率也随之提高,当POD浓度为5U/mL时BPA已降解44.64%,在浓度增加到10U/mL时BPA降解率达到99.67%,当POD浓度为25U/mL及以上时BPA已完全降解.由此可见,金鱼藻POD降解BPA的最低浓度为10U/mL.从图3(b)可以看出,当 H2O2的浓度从0.5mmol/L增加到5mmol/L时,BPA降解率显著升高,由 33.1%增加至 99.8%,几乎完全降解,当H2O2的浓度进一步增加时, BPA降解率开始下降,在 H2O2浓度为20mmol/L时BPA降解率减至52.6%.表明BPA降解的最适 H2O2浓度范围是 1～5mmol/L.金鱼藻POD降解BPA的温度适应范围较大.在温度为10℃时,BPA降解率即超过90%,随着温度增加BPA降解率逐渐升高,在 30～50℃时 BPA 的降解率全部超过99.5%;当温度超过60℃时,POD对BPA的降解率开始下降,在温度增加至 80℃时降解率为40.6%,不过在 90℃高温时仍然有 18.4%的 BPA 得到降解(图3(c)).如图3(d)所示,在pH值为3时,BPA有55.2%得到降解.随着pH值增加,BPA降解率也随之提高.在pH5～7范围内,BPA 降解率维持在 97.6%～99.8%,当pH＞7时,BPA降解率有所下降,在pH值为9时BPA降解率维持在36.2%.由此表明金鱼藻POD在降解BPA时pH值的作用范围非常宽泛,而最适降解条件发生在酸性～中性范围.

图3 不同条件对金鱼藻POD降解BPA的影响Fig.3 Effect of different conditions on degradation rate of BPA by POD from C.demersum

杜红霞[39]探讨了辣根过氧化物酶(HRP)对 BPA的降解性能,发现 0.5U/mL HRP在 120min内对0.2mmol/L BPA的降解效果最好,降解率为63%,该酶促反应的最适温度为25℃,最适pH值为6, H2O2最适浓度为0.4mmol/L.马铃薯过氧化物酶在浓度为200U/mL,H2O2浓度为1.0mmol/L,温度和pH值分别为25℃和6的条件下反应10min后,可将0.8mmol/L的BPA降解99%以上[40].从润楠成熟叶片中分离得到的 POD在浓度大于 50U/mL,H2O2浓度为0.1mmol/L,温度为10～60℃,pH4～7的条件下,经过3h对 0.2mg/L的 BPA清除率可达到 95%以上[41].在25℃,pH值为4～8条件下,1.28U/L的萝卜 POD和0.8mmol/L的H2O2与0.5mmol/L BPA反应3h后,BPA浓度减少超过85%[42].由前人研究结果可知,不同植物来源POD对BPA的降解特性有着较大差别,在不同条件下对BPA的清除效率也有所不同.大多数POD都是在常温下才具有较好的降解效果,本研究发现金鱼藻 POD在温度较高的情况下也能发挥很好的降解作用,这可能归因于金鱼藻POD良好的热稳定性,此特性也是该酶优于其他来源POD的一个重要方面.金鱼藻POD宽泛的温度以及pH值作用范围使其在降解 BPA时可以保持较高的活性,加上该酶与 BPA有着较高的亲和能力,因此在浓度较低,时间较短的条件下可以快速降解 BPA.这些结果表明相对于其他陆生植物和水生植物而言,具有优良特性的金鱼藻 POD可能是该植物体可以高效降解BPA的重要原因.

2.4 金鱼藻POD降解BPA的动力学研究

如图4所示,拟合直线相关系数达到 0.9992,可见金鱼藻POD降解BPA的反应动力学符合米氏方程.根据方程斜率和截距可计算出该反应的米氏常数 Km和最大反应速度 Vmax,分别为0.09mmol/L和9.71mmol/(L·h).Km是估计反应底物与酶结合情况的平衡常数.Km值越低,酶与底物的亲和力越高.金鱼藻POD的Km值较低,说明金鱼藻POD与BPA有着较高的亲和能力,这也与其高效降解 BPA的结果一致.杜红霞[39]对辣根POD降解BPA进行了反应动力学的研究,测得的米氏常数为0.093mmol/L,与本实验结果相近,说明金鱼藻POD降解BPA的动力学特征与辣根POD比较相似.

图4 金鱼藻POD降解BPA的双倒数曲线Fig.4 Lineweaver-Burk plot for the degradation of BPA by POD from C.demersum

2.5 BPA降解产物的毒性分析

由图5可知,不同处理对斑马鱼血液中VTG含量有着不同的影响.A组加入BPA后第1d斑马鱼就全部死亡,因此未检测其体内的VTG含量;B组处理中斑马鱼接触的是金鱼藻纯化POD与BPA完全反应之后的混合物,溶液中含有的主要是 BPA的降解产物,没有BPA残留,经测定,斑马鱼体内VTG含量为0.18mg/L;C组斑马鱼生长在自来水中,其体内VTG含量为0.22mg/L.由此可见,与空白对照C组相比, B组中斑马鱼VTG含量并未显著增加(P＜0.05),说明金鱼藻 POD将 BPA完全降解后,消除了 BPA对斑马鱼产生的致死作用,其体内雌激素含量与正常水平非常接近,表明BPA被POD降解后其降解产物对斑马鱼也不具有雌激素效应.

BPA作为一种内分泌干扰物,主要是通过引起不利的生化和生理变化来改变细胞的组织结构和组织器官的功能,从而干扰生殖效率[43].生殖系统中颗粒细胞通过产生雌激素在卵巢生理中起着重要的作用,而 BPA 作用的靶标已被证明是卵巢颗粒细胞,它可以通过破坏卵巢类固醇生成以及增加血管内皮生长因子(VEGF)的量来干扰颗粒细胞功能,从而对生殖效率产生重要影响[44].VTG已被广泛用作BPA对鱼类内分泌干扰标志物[45].本研究将斑马鱼暴露在金鱼藻POD与BPA完全反应后的水中,测定了斑马鱼血液中VTG含量,结果表明,此含量与对照相比并没有显著变化,说明BPA经金鱼藻POD处理后,其对斑马鱼的雌激素效应得到清除,由此可以推断其降解产物不再具有内分泌干扰作用.Sakuyama等发现与 BPA共同培养的雄性青鳉鱼(Oryzias latipes)血液中的VTG含量显著增加,而经辣根POD处理BPA后,青鳉鱼未出现雌激素活性增加的现象,表明HRP能够降解BPA,因此对青鳉鱼不产生雌激素效应[46],本文结果与之相一致,后续研究将对金鱼藻POD对BPA的代谢产物做进一步的分析和鉴定.

沉水植物是湖滨带河滨带浅水水体常见水生植被,适应性强,分布广,生物量大,是浅水水体污染物植物修复的主要工具类型[47].而BPA是一种全球性的污染物[48],水环境则是 BPA的主要富集区[49-50].因此研究水生植物对水环境中BPA的清除有着重要的生态学意义和实际应用价值.目前关于BPA降解的文章都是针对陆生植物,且研究思路主要是直接利用植物的纯化POD处理水中BPA污染物,并非探讨植物体对 BPA 的生物降解机制,从生态系统角度出发的研究报道很少,而清楚了解水生植物降解BPA污染物的机理和机制可以为实际水体植物修复工作的推广和应用提供重要的理论依据.本文前期通过植物筛选发现,相较于其他几种水生植物,金鱼藻具有更高效降解 BPA 的能力,在此过程中 POD可能起着关键作用[26].本研究表明,金鱼藻 POD比其他来源同类酶具有更优越的特性,比如活性很高,温度和 pH值作用范围更宽泛等,这些结果可以为金鱼藻对BPA的降解能力远远超过其他陆生植物和水生植物提供酶学依据和理论支持.另外还发现BPA经金鱼藻POD降解后代谢产物对斑马鱼也不产生雌激素效应.

3 结论

3.1 金鱼藻POD具有较广谱的温度和pH范围.在温度为70℃,pH值为7,H2O2浓度为5mmol/L时POD酶活力最大.

3.2 金鱼藻POD对水中BPA有较高的降解效率,且具有较宽的作用范围.金鱼藻POD降解BPA的最佳条件为:活力10U/mL及以上,H2O2浓度1～5mmol/L,温度 30℃, pH 值 5～7.在此条件下,15min内对0.02mmol/L BPA的降解率可达到99.67%～100%.金鱼藻 POD对 BPA的降解动力学米氏常数 Km为0.09mmol/L,最大反应速度为9.71mmol/(L·h).

3.3 经金鱼藻POD降解后,BPA对斑马鱼的雌激素效应得到清除,其降解产物也不再具有内分泌干扰作用.