章忠强， 梁硕洲， 司中洲， 齐海智

1 中南大学湘雅二医院 肝脏移植科， 长沙 410011；2 中南大学湘雅二医院 移植医学研究中心， 长沙 410011

肝移植是治疗急慢性肝衰竭、晚期肝硬化等终末期肝病最为有效的治疗手段[1-2]。据世界卫生组织统计，目前我国HBV感染者达8600万人，HCV感染者约1000万人，每年约33万人死于HBV或HCV感染导致的晚期肝硬化，而肝移植是能够挽救这些患者生命的唯一手段。据中国肝移植注册中心统计，我国每年约有20余万人正在等待肝移植手术，但最终能够获得肝脏供体的患者仅7000人左右，大多数患者在等待供体的过程中死亡，肝脏供体短缺状况在我国尤为突出。

异种器官移植作为潜在解决器官短缺的方法，一直是生物医学领域关注的焦点[3-4]。 人类从1968年开始基于大动物异种肝移植模型的实验研究[5]，早期的动物异种肝移植研究将野生型猪(未行基因编辑的猪)的肝脏移植至灵长类动物体内，但物种之间的不相容性导致严重的超急性排斥反应(hyperacute rejection, HAR)以及弥漫性的血管内凝血，受体很快死亡[6-7]。

现代基因工程技术(CRISPR-Cas9技术等)通过敲除供体猪体内与受体天然抗体结合抗原的基因，以及植入人的补体相关调节蛋白抑制受体体内补体系统的激活，并配合新型免疫抑制剂的应用，避免了HAR的发生，HAR在一定程度上得到了较好的控制，从而使动物异种肝移植研究取得进一步的发展[4,8-9]，受体最长生存期延长至29 d(表1)。

野生型猪的肝移植入人体或非人灵长类动物体内后，随着受体体内大量的针对移植物表面抗原的先天性抗体的结合，诱发抗体介导的HAR，导致移植物血管内血栓形成、出血性坏死、内皮细胞损伤以及IgM、IgG、C3沉积[19]，外观出现明显的坏死性改变(图1)，受体通常在30h内死亡[18]。猪体内的半乳糖-α1,3-半乳糖是诱发HAR的主要靶抗原，其在人类、猩猩和旧世界猴的体内不表达，而这些灵长类动物体内通常存有大量针对该抗原的抗体(抗-Gal抗体)[20]。通过将野生型猪细胞内的α1,3-半乳糖基转移酶基因敲除，并表达人的补体调节蛋白(如CD46、CD55、CD59)的基因工程猪作为异种肝移植供体，以及免疫抑制剂的应用，可防止HAR的发生，受体生存期得到了一定时间的延长，但血小板持续减少、血栓性微血管病、消耗性的凝血异常成为了受体死亡的主要原因[12, 16-17, 21]。

表1 基因工程猪-非人灵长类动物异种肝移植受体存活时间

图1异种肝移植术后发生超急性排斥反应(野生型猪肝供体移植到恒河猴)

虽然在原位肝移植模型移植物内或者异位辅助性肝移植术后短期尚未发现明显排斥反应证据，但是在存活26 d的异位辅助性肝移植模型的有13种基因编辑的移植物中出现了明显的急性体液性排斥反应，并伴有炎症损伤、间质出血和血栓性微血管病[18]。因此，随着受体时间的延长，急性体液性排斥反应将很可能是导致异种肝移植物失功的主要因素之一。明确异种肝移植急性体液性排斥反应的机制，了解其防治策略，对我国开展异种肝移植研究具有重要的意义。

1 急性体液性排斥反应的机制

急性体液性排斥反应是由受体体内抗体结合异种抗原后通过激活补体系统和固有免疫细胞[巨噬细胞、自然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞等]反应，导致异种移植物血管内皮细胞被激活和损伤，并在数天或数周的时间内出现局灶性缺血、弥漫性血管内凝血，最终出现结构和功能破坏的过程[20]。

1.1 抗-Gal和抗-非Gal抗体 受体体内的抗-Gal抗体、抗-非Gal抗体结合异种移植物细胞表面的Gal或非Gal抗原，激活受体补体系统级联反应，是诱发急性体液性排斥反应破坏异种移植物的主要原因[18]。通过将非人灵长类动物受体体内的Gal抗体去除，可有效抑制CD55和CD59异种移植物内急性体液性排斥反应的发生[22]，但即使是使用GTKO猪作为移植物，急性体液性排斥反应仍然会发生[23]，这表明抗-Gal和抗-非Gal抗体均可以诱发急性体液性排斥反应。胞苷酸-N-乙酰神经氨酸羟化物(N-glycolyl neuraminic sialic acid，Neu5Gc)是胞苷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase，CMAH)编码基因的产物，是在2002年发现的一个重要的非Gal抗原，由于Neu5Gc在人体内不表达，人类体内逐渐形成高滴度的抗-Neu5Gc抗体[24]。另一个重要的非Gal抗原为聚多糖SDa，为β-1,4-N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(Beta-1,4-N-acetylgalactosaminyltransferase2，β4GALNT2)编码基因的产物[25]。SDa抗原的去除可明显降低供体猪的抗原性，从而减轻灵长类动物针对异种抗原的非-Gal抗体的作用[26]。人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)和猪白细胞抗原Ⅰ类(SLA-Ⅰ)具有的共同表位可能导致人和猪之间的交叉免疫反应。同时，人体内抗-HLA-Ⅱ抗体可交叉结合SLA-Ⅱ抗原。因此，HLA和SLA相关抗原抗体同样可能介导急性体液性排斥反应[27-28]。然而，如果肝脏移植物或者受体的生存期比较短，血小板持续减少、血栓性微血管病、消耗性凝血异常等问题可以掩盖抗非-Gal抗体介导的急性体液性排斥反应对移植物或受体的影响[29]。

1.2 固有免疫细胞 固有免疫细胞通过抗体依赖性细胞毒性作用激活、损伤移植物内皮细胞，同样可以诱发异种移植急性体液性排斥反应，但其重要性目前暂未明确[20, 29]。

巨噬细胞可以被受体体内的抗异种移植物抗体(如抗Gal或抗非-Gal等天然抗体)的Fc以及补体受体激活，活化的巨噬细胞通过分泌各种促炎细胞因子、活性氧等，参与针对移植物的抗体及补体依赖性的急性体液性排斥反应[30-31]。

NK细胞可通过抗体依赖性细胞毒性机制参与异种体液性排斥反应，移植物内皮细胞表面沉积的抗体被NK细胞上的FcγRⅢ识别，通过导致异种移植物内皮细胞表面黏附分子表达增加，诱导免疫细胞浸润及炎症因子释放，促使异种移植物细胞凋亡[32]。NK细胞还可以通过CD40-CD154途径与受体脾脏边缘区B淋巴细胞相互作用，促进抗体介导的急性体液性排斥反应[33]。

在异种移植中,中性粒细胞最早浸润到移植物内，移植物内存在抗体及补体的沉积促进中性粒细胞粘附并激活内皮细胞，通过抗体依赖性的体液性免疫反应介导异种移植物损伤[34-35]。

2 急性体液性排斥反应的防治

2.1 供受体移植前严格配型 前期研究[18-36]表明，抗非-Gal抗体仍然是诱导异种肝移植术后急性体液性排斥反应的主要原因，且Gal、Neu5Gc、Sda抗原均敲除的基因工程猪作为供体，抗非-Gal抗体介导的急性体液性排斥反应仍然无法完全避免。

因此，严格的移植前供受体交叉配型(包括针对供体的抗原抗体结合试验以及补体依赖性的供体细胞杀伤试验)，筛选最佳匹配的供受体组合，可以尽量减少异种肝移植术后抗Gal或非Gal抗体介导的急性体液性排斥反应的发生。

2.2 基因工程技术 通过基因工程技术敲除猪移植物内的相关抗原并修饰补体调节蛋白等，是防止或减轻异种肝移植体液性排斥反应的主要手段。Gal基因的敲除以及CD46、CD55、CD59等补体调节蛋白修饰的基因工程猪的肝移植物，可以防止HAR的发生，有效控制急性体液性排斥反应[11, 34]。GTKO/CD46基因型猪肝移植物在非人灵长类动物体内维持基本的肝功能7 d，移植物内未发现明显移植排斥反应[11]。GTKO基因型猪肝移植物作为异位辅助性供体，最长可在非人灵长类动物体内存活15 d，不出现严重的急性体液性排斥反应[14]。在异种原位肝移植模型中，GTKO基因型猪肝移植物可维持受体存活时间达29 d，且无明显移植排斥反应[17]。然而，13个基因编辑(PERV-KO/3-KO/9-TG)的基因型猪肝移植物在术后26 d的病理检查中发现了明显的体液性排斥反应[18]。

通过基因工程技术敲除抗原、修饰相关蛋白可显著防止异种肝移植急性体液性排斥反应的发生，但并不是基因的敲除及修饰的基因数量越多，急性体液性排斥反应发生的概率越小。因此，通过实验研究，进一步明确不同基因编辑组合供体(包括针对固有免疫细胞介导的免疫反应的基因编辑)在防止肝移植急性体液性排斥反应中的作用，更精准地进行基因敲除或修饰，优化供体的基因编辑组合，是预防异种肝移植急性体液性排斥反应的关键所在。

2.3 药物处理 异种肝移植受体接受免疫抑制及相关辅助药物的足量处理，是减少移植术后体液和细胞性排斥反应，减轻移植物损伤的主要方法。其中，眼镜蛇毒因子和激素分别通过作用于补体系统激活和移植术后炎性反应、炎症因子风暴，抑制急性体液性免疫反应的发生[36]。此外，针对B淋巴细胞的抗CD20单克隆抗体(aCD20mAb，Rituxan)在减轻异种肝移植术后急性体液性排斥反应方面也具有一定的作用[37]，但其重要性有待进一步明确。

3小结

抗体介导和固有免疫细胞参与的急性液性排斥反应是基因工程猪-非人灵长类动物异种肝移植研究中需要特别注意的问题。急性体液性排斥反应可以快速导致异种移植物失功，并可能是阻碍进一步延长异种肝移植受体存活时间的关键因素。通过移植术前严格的供受体交叉配型、选择合适的基因工程猪供体基因型以及眼镜蛇毒因子和激素等药物的规范足量使用，是目前减轻或避免基因工程猪-非人灵长类动物异种肝移植术后急性体液性排斥反应的主要方法。然而，受体固有免疫细胞参与的异种肝移植急性体液性排斥反应的机制以及防治策略，亟需更深入的研究探索。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：章忠强、梁硕洲负责撰写论文；司中洲、齐海智负责写作思路，指导撰写、修改文章并最后定稿。