罗恒 卫向红 吴清明 向世强 张若涵

肝脏是脂类合成和代谢的主要器官，肝脏受损与脂质代谢紊乱密切相关，近年来发现由于脂质代谢紊乱导致的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)发病率逐渐上升[1]。低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)和高密度低脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)水平异常与HCC的发展密切相关[2]。LDL和HDL可根据不同分离技术分为多种亚型，比如：凝胶电泳方法可将LDL分为7种亚型LDL1～7，HDL可分为HDL2a、HDL2b、HDL3a、 HDL3b 和 HDL3c等多个亚型[3-4]。这些亚型与多种疾病的发生和发展独立相关，但对LDL、HDL亚型在HCC发生中的作用研究相对较少。我们研究了LDL、HDL亚型在肝癌发生中的作用和其对乙型肝炎(hepatitis B virus，HBV)感染相关性HCC患者预后评估的价值，为进一步探索HBV相关性肝癌的发病机制和提高肝癌患者的生成预后提供新的思路。

对象和方法

一、对象

在2017年1～12月期间，前瞻性纳入90例在空军军医大学第一附属医院接受诊断和治疗的肝病患者，病因学有明确的HBV感染史，且经乙肝五项定量或HBV-DNA检测确定为乙肝病毒携带者。根据临床诊断标准(4项中至少符合2项)或肝穿刺组织学检查诊断，确诊为HCC的患者纳入肝癌组(n=30)，男性患者21例，女性患者9例，平均年龄(54.07±10.13)岁，出现肝硬化但证实尚未发生癌变的患者纳入肝硬化组(n=30)，男性患者19例，女性患者11例，平均年龄(54.23±8.11)岁。其余患者则纳入慢性肝炎组(n=30)，男性患者22例，女性患者8例，平均年龄(55.83±9.21)岁。纳入标准：就诊前无抗肿瘤治疗史；具备完善的临床信息，包括B型超声、相关血清学检查和肝活检等。合并酒精性/非酒精性肝炎、丙型病毒、戊型病毒感染的患者被排除在外，此外肝衰竭和肾脏功能严重障碍的患者也应该被剔除研究。本研究的所有患者均给出了书面的知情同意书，同时本研究得到了我院伦理委员会批准。

二、方法

1.检测指标：过夜禁食12 h以上后，平行收集2份静脉血样本3 ml和4 ml，离心获得血清后，一管送往检验科，在2 h内通过标准酶比色法检测总胆固醇、HDL-C，利用Friedewald公式计算LDL-C水平。另一管保存在-80 ℃，在分析前再解冻。另一管保存在-80 ℃，在分析前再解冻。使用Lipoprint系统(美国Quantimetrix公司)和聚丙烯酰胺凝胶电泳对LDL亚类进行鉴定，电泳时间60 min，电流3 mA，利用数字扫描仪和全自动计算机对电泳结果进行量化。LDL亚类分布为七个带(LDL1～7)，与梯度凝胶电泳获得的数据一致。大LDL：LDL1～2，小而密LDL(small dense low density lipoprotein，sdLDL)：LDL3～7。利用二维凝胶电泳和免疫印迹法对HDL亚类进行鉴定，使用标准曲线(包括牛血清白蛋白、铁蛋白和甲状腺球蛋白)对HDL浓度值进行校准，将每个HDL亚类的相对百分比浓度乘以样品中的apoA-I浓度得出相对浓度apoA-I的每个HDL亚类的含量(mg/L)。

三、统计方法

使用SPSS26.0软件进行数据分析。将计量资料进行K-S正态性检验和方差齐性分析，所有计量资料均符合正态分布，用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用事后LSD-t检验；计数资料以例(%)表示，进行χ2检验。采用Logistic回归模型分析影响肝病患者发生肝癌的危险因素。受试者工作特征(Receiver operating characteristic，ROC)曲线分析LDL、HDL亚类对肝癌发生的预测价值。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1.慢性肝炎、肝硬化和肝癌患者临床资料比较见表1。 与慢性肝炎组比较，肝硬化组AST、LDL-C水平显著降低，肝癌组总胆固醇显著增加， AST、HDL-C水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与肝硬化组比较，肝癌组总胆固醇显著增加， AST、HDL-C水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 3组临床资料比较

2.慢性肝炎、肝硬化和肝癌患者LDL和HDL亚型比较见表2。 与慢性肝炎组比较，肝硬化和肝癌患者sdLDL水平显著上升，HDL2和HDL3水平显著降低，。与肝硬化组比较，肝癌患者sdLDL水平显著上升，HDL2和HDL3水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 3组LDL、HDL亚型比较(mg/L)

3.Logistic回归模型分析影响HBV相关性肝癌发病风险的临床因素 经Logistic模型分析，单因素分析结果显示总胆固醇、HDL、sdLDL、HDL3都是影响慢性肝病患者发生肝癌的危险因素，将上述变量纳入多因素模型，结果显示sdLDL水平上升和HDL3水平下降是影响慢性肝病患者发生肝癌的独立危险因素。见表3。

表3 logistic模型分析影响慢性肝病患者发生肝癌的临床因素

4.ROC曲线 血清sdLDL、HDL3预测肝癌的AUC为0.899(0.835～0.964)、0.816(0.731～0.902)。截断值为28.295mg/L、20.06mg/L，特异度为0.883、0.967，灵敏度为0.867、0.600。见图1。

图1 ROC曲线分析sdLDL、HDL3对肝癌的预测价值(A)sdLDL；(B)HDL3

讨论

HCC是来自肝脏上皮细胞的恶性肿瘤，发病率和死亡率分别排到了恶性肿瘤的第6、4位，影响肝癌发生的因素很多，包括：病毒感染、酗酒、黄曲霉素暴露等[5]。近年来发现在慢性肝脏疾病中存在脂蛋白异常，肝脏脂质失调是肝脏受损的基本特征[6]。在本研究中发现，在肝受损患者中存在脂蛋白代谢异常，特别是LDL亚组sdLDL和HDL亚组HDL3，较高的sdLDL和较低的HDL3水平提示慢性HBV相关性肝病患者更容易发生肝癌。

肝脏是重要的脂质代谢器官，是产生内源性脂质和脂蛋白聚集的中心。脂质代谢异常与肿瘤形成、进展以及治疗后的预后显著相关。肝脏可以合成约75%的内源性胆固醇，LDL-C主要通过肝细胞合成，LDL-C和LDL水平反映了肝脏合成能力。当肝脏受损后，LDL-C和LDL水平开始下降[7]。LDL主要可划分为大LDL和sdLDL，近年来发现不同亚组份的LDL对疾病的发生具有不同的作用。比如与甘油三酯、LDL等比较，在心血管疾病中sdLDL对预测冠心病等的发生更敏感，这可能与sdLDL导致更强烈的氧化应激反应，从而使内皮细胞受损坏死有关[8]。sdLDL的增加与肥胖、胰岛素抵抗相关，据报道，丙型病毒感染的患者在基于干扰素的疗法或任何DAA疗法清除丙肝病毒治疗后，可能会出现动脉粥样硬化病变，在开始治疗后的一年这部分肝炎患者血清sdLDL、LDL水平都显著升高。同时研究还表明了sdLDL的增加与颈动脉中膜厚度密切相关[9]。这提示我们对于肝炎患者在治疗后的一段时间内对sdLDL水平的监测是具有意义的。同时有研究发现，在日本男性脂肪肝的受试者中，其sdLDL显著增加[10]。在另一项非酒精性脂肪肝炎的研究中发现，sd-LDL与超声心动图显示的控制衰减参数值呈正相关，同时还与肝纤维化程度呈现正相关[11]。在肝外胆管癌中，Guo等[12]发现sd-LDL水平升高，而在胆汁淤积缓解后，sd-LDL降低。我们据此猜测，在慢性肝疾病的进展过程中，持续的sdLDL水平升高可能是加剧疾病的原因。我们发现，在HCC患者中，LDL-C的水平增加，同时sdLDL水平也显著上升。而在风险模型分析后也证实了血清sdLDL水平是影响HBV相关性慢性肝病患者发生癌变的独立危险因素。此外，LDL亚型还与肝脏疾病治疗后的预后相关。Siddiqui等[13]发现sd-LDL对肝移植后的心血管事件发生独立相关，sdLDL可以独立的预测肝移植后的心血管事件发生风险。

HDL-C是胆固醇在肝脏代谢的一部分，最近的研究显示，在肝脏肿瘤组织中HDL-C水平显著降低。在HCC发生时，胆固醇的代谢和合成途径都受到损伤，因此在血浆中胆固醇水平降低。而随着肝脏受损的进展，肝脏对HDL-C的消耗逐渐增加[2]。HDL2和LDL3是HDL的亚组成分，有研究显示在肝硬化患者中，随着疾病的进展，稳定型肝硬化、急性代偿期、肝衰竭患者中的HDL-C、HDL2-C、HDL3-C的水平依次降低，HDL-C、HDL2-C、HDL3-C可以作为肝硬化疾病进展和存活的可靠性预测因子[14]。HDL2(HDL2b、HDL2c)属于大颗粒HDL，HDL3(HDL3a、HDL3b、HDL3c)属于小颗粒HDL，有研究发现在正常血脂血清中使用肝癌细胞进行孵育，血清中的HDL2b降低，而HDL3a释放增加[15]。提示我们肝癌患者中HDL亚组水平异常。Hayashi等[16]研究者证明在经过药物治疗12个月后，2型糖尿病患者血清HDL2、1bLDL-C的水平显著上升，同时sdLDL-C水平降低。这也提示我们LDL、HDL亚型在内环境脂质异常中具有重要作用，具有反映内环境脂质稳态的潜能。我们的研究发现在肝癌患者中血清HDL3的水平降低。

总之，我们通过分析不同肝病患者血清LDL、HDL亚型，发现血清sdLDL和HDL3水平与HBV相关性肝癌的发生风险有关，这值得我们在未来进行更深入的探讨。在HBV感染的慢性肝疾病患者中，对血清LDL、HDL亚型进行监测和鉴定，有助于预测疾病的进展风险，并及时进行干预。