高智杰，蔡伊萍，陈凯莉，陈婷婷，林国荣

（莆田学院环境与生物工程学院，福建省新型污染物生态毒理效应与控制重点实验室，福建 莆田 351100）

0 引言

腐乳中富含有机酸、醇、酯、大豆异黄酮、大豆多肽等风味物质，具有抗氧化、降低血压、降低胆固醇、防癌抗突变、改善阿尔兹海默病等作用[1-2]。豆腐乳在瓶内后期发酵和贮藏过程中主要发生的美拉德褐变使色泽不断加深，不仅影响了其外观和货架期，还会造成风味及营养物质的损失，特别是对豆类食品优质蛋白质的流失[3]。根据菌种类型可将腐乳分为毛霉腐乳、根霉腐乳、细菌腐乳和无菌腐乳等[4]；目前，我国生产腐乳的菌种以毛霉菌为主，酵母菌、米曲霉、根霉等多种菌种混合发酵[5]。

褐变现象从本质上可分为酶促褐变和非酶促褐变2 种，腐乳的褐变属于酶促褐变中的羰氨反应褐变又称美拉德反应，主要发生在水果、蔬菜等食物中[6]。因为毛霉分泌的儿茶酚氧化酶在游离氧存在下催化了各种酚类氧化成醌，进而聚合为黑色素所致，引起腐乳颜色从黄到褐逐步加深，但隔绝氧气就可防止这些变化。葡萄糖氧化酶（GOD） 可起到除去卤水中的氧气，从而抑制褐变，而且葡萄糖氧化酶具有酶的专一性，不会与卤水中的其他物质反应[7]。因此试验通过在后酵汤料中添加不同剂量的葡萄糖氧化酶和半胱氨酸，来确定适宜的抑制褐变所需的葡萄糖氧化酶和半胱氨酸的量。在此基础上，进行进一步提升，以葡萄糖氧化酶和半胱氨酸适宜比例配制复合抗褐变剂，进行对比筛选，研究最合适的抗褐变剂添加量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原料：老豆腐、食盐；毛霉、米根霉、酵母、米曲霉等，沂源康源生物科技有限公司提供。

试剂：半胱氨酸，上海源叶生物科技有限公司提供；葡萄糖氧化酶（食品级），浙江一诺生物科技有限公司提供；福林- 酚试剂、碳酸钠、三氯乙酸、pH 值7.2 磷酸缓冲溶液、酪蛋白，酪氨酸等，国药集团化学试剂有限公司提供。

仪器：DHP-9052 型电热恒温培养箱；UV1240型紫外可见分光光度计，日本岛津公司产品；pH计，梅特勒- 托利多仪器（上海） 有限公司产品；CT3 型质构仪，美国BROOKFIELD 公司产品。

1.2 工艺流程

原料→预处理→前期发酵→搓毛腌制→后期发酵。

原料选用市售的老豆腐，由于其硬度、成型性较佳，在后酵与贮存过程中不会由于蛋白质降解过度造成腐乳坯体柔软过度而坍塌[8]。发酵时的乳坯水分应保持在70%左右，试验采用蒸煮的方法去除豆腐中多余水分后，将豆腐切成2 cm×2 cm 的乳坯，然后为乳坯接种不同的菌种，置于25 ℃恒温培养箱中发酵，待2～3 d 后乳坯表面形成致密的毛霉层；将毛坯进行搓毛腌制，1～2 d 后将毛坯装罐，用10%的卤水密封发酵。

1.3 豆腐乳中优质菌种的筛选

腐乳的生化指标主要在后酵期间进行测验，后期发酵是腐乳特有风味形成、蛋白质降解的主要阶段，对腐乳后酵过程中生化指标的变化进行分析，可得到单菌种、混菌发酵腐乳品质的差别[9-10]。试验通过将毛霉、米根霉、米曲霉以单霉的形式发酵，并且以毛霉+米根霉、毛霉+酵母、毛霉+米曲霉的形式按1∶1 的配比进行混合发酵，筛选出最适的菌种发酵形式。

1.4 低褐变豆腐乳的制备工艺

首先，将同一批次生产的的盐坯腐乳装入瓶中，产品的量为150 mL，装罐后密封于25 ℃恒温培养箱中后酵成熟。向豆腐乳腐乳体系中添加GOD 以0，0.01%，0.02%，0.03% （W/V） 的量至后酵汤料，研究GOD 对腐乳褐变的影响。其次，将豆腐乳腐乳体系中添加半胱氨酸质量分数梯度为0.10%，0.15%，0.20%，0.25% （W/V） 和复合抗褐变剂（GOD∶半胱氨酸为1∶9），研究其对腐乳褐变的影响。同时，制备正常生产条件下不添加抗褐变剂的豆腐乳，作为对照。

1.5 腐乳的抗褐变稳定性的研究

将低褐变豆腐乳制备工艺的产品置于25 ℃恒温条件下，每2 个月对腐乳的褐变程度指标进行测定，考查豆腐乳的抗褐变稳定性。

1.6 项目测定

1.6.1 蛋白酶活性测定

采用福林- 酚试剂法测定蛋白酶活力[11]。将1 g全豆腐乳毛坯料中的酶，在温度40 ℃、pH 值7.2 条件下，1 min 水解酪蛋白产生1 μg 酪氨酸，定义为1 个酶活力单位。

1.6.2 褐变程度的测定

把腐乳汤汁过滤，准确吸取2 mL 滤后样品用蒸馏水稀释3 倍，以转速4 300 r/min 离心15 min，取上清液用滤纸过滤得到澄清透明液体。以蒸馏水作空白，于波长A420测定吸光度。

2 结果与分析

2.1 豆腐乳中优质菌种的筛选

各菌种蛋白酶活力的比较见表1。

表1 各菌种蛋白酶活力的比较/U·g-1

由表1 可知，对比不同样品的蛋白酶活性，可以发现相较于单菌发酵，混菌发酵腐乳的蛋白酶活性更高，其中又以毛霉与根霉的菌种混合发酵效果更佳。蛋白酶活性越高，越有利于蛋白质的水解，而腐乳作为大豆制品，其自身含有40%的蛋白质，是人体所需蛋白质的主要来源。有研究表明，通过微生物发酵法水解蛋白生成肽的同时，部分苦味基团会得到排列重组，使得大豆肽的溶解性变得更好，而且没有异味和苦味。同时，毛霉不仅为腐乳提供包裹作用，还为后酵微生物提供营养物质，继续催化大豆蛋白的深度降解[12-13]。李顺等人[14]的研究表明，相较于单菌发酵，混合发酵在一定程度上不仅能弥补单菌发酵的某些不足，而且可以发挥单菌发酵的优势。因此，可以理解为混菌发酵比单菌发酵更全面，而混菌发酵中又以毛霉和根霉的组合效果更佳。因此，在菌种筛选的试验中，结果以毛霉与根霉按1∶1 的配比混合接种，进行后续操作。

2.2 豆腐乳抗褐变的研究

2.2.1 GOD 添加量对豆腐乳褐变的影响

GOD 添加量对米酱豆腐乳褐变的影响见表2。

表2 GOD 添加量对米酱豆腐乳褐变的影响 / %

由表2 可知，没有添加GOD 的腐乳褐变程度最深，后酵成熟豆腐乳的A420值均随着GOD 添加量的增大而逐渐降低，这与还原糖消耗量的变化趋势具有一致性；但当添加量增大到0.02%及以上时，褐变程度降低幅度不大，因此继续增加其用量对抑制腐乳体系褐变的意义不大，GOD 添加量以0.02%为宜。

2.2.2 半胱氨酸添加量对豆腐乳褐变的影响

半胱氨酸添加量对米酱豆腐乳褐变的影响见表3。

表3 半胱氨酸添加量对米酱豆腐乳褐变的影响

由表3 可知，未添加半胱氨酸的腐乳褐变程度最深；豆腐乳的A420值均随着半胱氨酸添加量的增大而逐渐增加，在半胱氨酸添加量为0.10%时腐乳汤汁色泽最浅，腐乳的褐变程度最小。因此，半胱氨酸适宜添加量0.10%。

2.2.3 复合抗褐变剂添加量对豆腐乳褐变的影响

复合抗褐变剂添加量对米酱豆腐乳褐变的影响见表4。

表4 复合抗褐变剂添加量对米酱豆腐乳褐变的影响

由表2 ～表4 可知，添加0.01%GOD 酶豆腐乳的A420值为0.483，添加0.01%半胱氨酸豆腐乳的A420值为0.403；在复合抗褐变剂为0.10%的添加量下，A420值为0.352，腐乳汤汁色泽最浅，褐变程度最小，复合抗褐变剂对豆腐乳褐变比单一效果要好。但复合抗褐变剂处理的豆腐乳体系的A420值呈现先下降后上升的趋势。因此，复合抗褐变剂适宜添加量为0.10%。

2.4 低褐变豆腐乳在贮藏过程中的抗褐变稳定性

低褐变米酱豆腐乳在贮藏期内的抗褐变稳定性见表5。

表5 低褐变米酱豆腐乳在贮藏期内的抗褐变稳定性

由表5 可知，当恒温贮藏10 个月后，传统豆腐乳的A420值为1.762，表现为褐变程度极高的酱色，而低褐变腐乳的A420值只为0.732，褐变程度比传统豆腐乳贮藏4 个月时A420值0.843 还低了15.2%，仍然显示较浅色泽，表现出很好的抗褐变能力。在10 个月贮藏期间，豆腐乳汤汁的褐变程度随着时间的延长而增强，褐变不断加深，低褐变豆腐乳体系的吸光值在整个贮藏期内低于传统豆腐乳产品。褐变度贮藏10 个月与传统米酱豆腐乳贮藏3 个月相当。因此，低褐变豆腐乳在保存中显示很好的抗褐变稳定性。

3 结论

腐乳发酵时，采用混合菌种发酵（毛霉与根霉按1∶1 的配比） 相较于单个菌种发酵更有利于腐乳的品质和口感，也有利于将豆腐所含有的蛋白质水解为多肽和各种氨基酸，促使腐乳形成特有风味。而在腐乳的后酵和贮藏期间发生的美拉德褐变，通过添加抗褐变剂能够起到有效的抑制作用，单一添加0.02%的葡萄糖氧化酶和单一添加0.10%半胱氨酸都可以起到对腐乳发酵过程中抑制褐变的效果，而复合抗褐变剂适宜添加量为0.10%比单一效果更好。适量添加复合抗褐变剂的腐乳的色泽和滋气味等指标都得到了一定的提高，且在长期贮藏过程中仍显示出优异的抗褐变稳定性。