王 陶，李 文，董玉玮，李同祥，贺 羽

(徐州工程学院 江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室，江苏 徐州 221018)

近年来，随着我国社会经济的不断发展，废水废渣随意排放，导致土壤重金属、有机物污染日益严重,重金属污染引起的食品安全、环境问题已引起人们关注[1-2].全国土壤总的点位超标率为 16.1%，其中重金属镉是最主要的污染物，镉的点位超标率达到 7.0%，远远超过其他污染物[3].由于镉移动性大、毒性高、蓄积性强、污染面积广被称为“五毒之首”[4]，可造成细胞氧化损伤，引起DNA断裂，破坏细胞内含物，降低酶的活性，同时镉对人体还有一定的“三致”作用，对人类的健康构成严重威胁[5-6].

传统处理重金属污染的方法有很多，主要是膜分离法、离子交换法、化学沉淀法、活性炭吸附法、氧化还原法等物理和化学方法[7]，这些方法虽各具特点，但也存在一定局限性，比如投资成本高、技术要求高、能耗高、选择性低、释放副产物、产生二次污染等，所以逐渐被高效、廉价的生物吸附法所取代.由于微生物繁殖快、细胞数量多、比表面积大、成本低，具有能够处理低浓度污染或大面积污染等的独特优势，有良好的生态效益和应用前景[8].镉污染的微生物修复已成为当今食品科学、环境科学等的热点研究领域，也是最具有挑战性的研究方向之一[9].现有研究表明，酵母菌对重金属具有良好的吸附性，可以应用于食品发酵工业及环境污染治理领域.酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)[10-11]、热带假丝酵母(Candidatropicalis)PS33[12]、异常威客汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)[13]、库德毕赤酵母(Pichiakudriavzevii)[14]、红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)[15]等对 Cd2+、Pb2+等离子具备一定的吸附性能和清除能力.由于不同微生物菌株和重金属相互作用的复杂性及其细胞本身结构的差异性[16]，菌株在耐镉和吸附镉的能力等方面还需提高.同时，不同菌株对重金属的耐受及基本特性存在差异.因此，有必要开展高耐镉酵母菌种质资源的挖掘工作，进一步筛选对重金属具有良好吸附特性的酵母菌株，建立优势菌种库[17].

前期选育得到一株高耐镉酵母菌株QN-3，经鉴定为Cystobasidiumoligophagum，因此，本研究进一步观察其细胞形态，研究其生理生化特征，对其进行高镉固体培养基耐镉特性研究，并优化液体耐镉培养条件，通过透射电镜观察镉在菌体表面的沉积作用，以期为工业化生产应用提供重要的菌种.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌株：酵母菌CystobasidiumoligophagumQN-3；CdCl2·2.5H2O，分析纯，国药集团化学试剂有限公司.

1.2 培养基

高镉PDA固体培养基：蔗糖20 g，马铃薯200 g，加2.5水合氯化镉母液，使Cd2+质量浓度为250、300、400、600、700、800、900、1 000、10 000、11 000、20 000、22 000、24 000 mg/L，琼脂粉20 g，加蒸馏水至1 000 mL，121 ℃灭菌20 min.

PDA液体培养基：蔗糖20 g，马铃薯200 g，加蒸馏水至1 000 mL，121 ℃灭菌 20 min.

PDA固体培养基：蔗糖20 g，琼脂粉20 g，马铃薯200 g，加蒸馏水至1 000 mL，121 ℃灭菌20 min.

高镉PDA液体培养基：在相应Cd2+质量浓度高镉PDA固体培养基基础上，去除琼脂粉即可.

1.3 仪器与设备

TU-1810紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；A3AFG-13原子吸收分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司；Hitachi7650透射电子显微镜,日立(中国)有限公司；酸度计,上海力晶科学仪器有限公司；生物显微镜,南京江南永新光学有限公司；64RL高速冷冻离心机,美国Beckeman公司; XT-9800型多用预处理加热仪,上海新拓微波溶样测试技术有限公司.

1.4 方法

1.4.1 酵母菌株QN-3对镉的耐受性

将实验室保藏的高耐镉酵母菌株QN-3进行活化，取50 mL液体PDA培养基装在150 mL摇瓶中，接入菌液，体积分数6%，于恒温摇床中28 ℃培养72 h.分别转移接种到不同含量高镉固体PDA培养基中，28 ℃培养3 d，观察其生长情况和对镉的耐受情况.

1.4.2 酵母菌株QN-3细胞形态及生理生化特性

按照1.4.1将活化后的高耐镉菌株接种到固体PDA培养基上，28 ℃培养3 d后，挑取单菌落制作临时涂布片，观察其细胞形态，生理生化的鉴定参考标准方法[18]进行.

1.4.3 耐镉酵母菌QN-3的生长曲线[19]

在150 mL的锥形瓶中加入50 mL已灭菌的PDA液体培养基，在无菌操作条件下将活化好的菌按6%接种量分别接种于无镉液体PDA培养基，100 mg/L和500 mg/L 2种镉质量浓度的PDA液体培养基中，设置3个平行，空白对照组不接菌，然后放入28 ℃，120 r/min的恒温摇床进行振荡培养，接着每隔2 h取样，用可见分光光度计测OD600值，直至OD600不再增加，实验重复3次，取平均值.以培养时间为横坐标，培养液OD600值为纵坐标，根据实验测定结果绘制生长曲线图.

1.4.4 耐镉菌株QN-3培养条件优化

1)NaCl对QN-3生长的影响

按6%接种量分别接种于NaCl质量分数别为 0、1%、2%、3%、4%、5%的100 mg/L和500 mg/L 2种镉质量浓度PDA液体培养基中，考察NaCl对QN-3生长的影响.

2)pH对QN-3生长的影响

按6%接种量分别接种于pH值别为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的100 mg/L和500 mg/L 2种镉质量浓度PDA液体培养基中，考察pH对QN-3生长的影响.

3)接种量对QN-3生长的影响

按1%、2%、4%、6%、8%、10%接种量分别接种于100 mg/L和500 mg/L 2种镉质量浓度PDA液体培养基中，考察接种量对QN-3生长的影响.

4)装液量对QN-3生长的影响

在150 mL的锥形瓶中装入 10、30、50、70、90 mL灭好菌的PDA液体培养基，按6%接种量分别接种于100 mg/L和500 mg/L 2种镉质量浓度的PDA液体培养基中，考察装液量对QN-3生长的影响.

5)温度对QN-3生长的影响

按6%接种量分别接种于100 mg/L和500 mg/L 2种镉质量浓度PDA液体培养基中，放入温度分别为 4、20、25、28、30、32、37 ℃恒温摇床培养，考察温度对QN-3生长的影响.

1.4.5 耐镉酵母菌QN-3对镉的吸附特性

1)QN-3在不同镉离子质量浓度培养基中吸附率的测定

配制镉质量浓度分别为50、100、300、500、800、1 000、2 000、4 000 mg/L的PDA液体培养基，在最佳生长条件下培养4 d后，8 000 r/min离心15 min，取上清液2 mL，加8 mL浓硝酸、1 mL 30%的双氧水在加热仪中消解，消解液用0.5%稀硝酸定容到10 mL，用火焰原子吸收分光光度计测吸光度，根据吸光度计算吸附率[20]，火焰原子吸收分光光度计的工作参数为：波长228.8 nm, 空气流量1.8 L/min, 灯电流2 mA，狭缝0.4 nm，背景校正为无.同时测定不同质量浓度镉标准溶液的吸光度，绘制镉标准曲线.

镉的生物吸附率计算方法为

式中：Qr为表示吸附率，%；Co为表示镉离子初始质量浓度，mg/L；Ce为表示吸附后镉离子最终质量浓度，mg/L.

2)透射电镜(TEM)法分析QN-3吸附特性

将培养好的酵母菌分别转接到0 mg/L、1 500 mg/L镉质量浓度的 PDA 培养基中培养，离心取菌体，用无菌水洗涤3次，收集干净的菌体，不同镉质量浓度的菌体各收集约1 g湿菌体.每个质量浓度菌体取 0.5 g 至10 mL 离心管中，加入戊二醛溶液，轻轻吹打菌体至完全溶解.用戊二醛定容至10 mL体积，放在4 ℃冰箱中24 h，保证戊二醛充分固定酵母菌细胞.将固定好的菌体进行离心，5 000 r/min 10 min；用0.1 mol/L，pH 7.2的PBS 对菌体反复清洗3次，每次10 min；用体积分数50%、70%、80%、90%的乙醇梯度脱水各15 min后，再用无水乙醇脱水2 次，每次30 min；用叔丁醇溶液进行3次置换，每次置换30 min；样品置换后取出，冷冻干燥机进行干燥；利用双面胶将样品粘到样品台上，观察面向上，准备观察；使用离子溅射仪为样品进行镀膜，该实验的样品需要镀10 nm金膜.

1.4.6 数据处理

所有实验数据均是3次重复结果的平均值，数据表示为x±s形式，利用SPSS 16.0对数据进行统计分析，采用Duncan’s ANOVA进行多重比较，P<0.05，P<0.01，均具有统计学意义.

2 结果与讨论

2.1 酵母菌QN-3对镉的耐受性

QN-3在不同质量浓度镉平板上的生长状况见图1.

图1 QN-3在不同浓度镉平板上的生长情况

由图1可以看出菌株QN-3对镉的耐受性较好，可在镉质量浓度最高为22 000 mg/L的平板上生长，QN-3菌落，表面光滑，质地黏稠，圆形突出，边缘规则，直径为1～2 mm，该菌有特殊味道.

2.2 QN-3细胞形态

显微镜观察结果如图2所示，QN-3细胞呈椭圆近圆形，呈典型酵母菌形态.

图2 QN-3细胞形态(400×)

2.3 生理生化特征

QN-3生理生化特征见表1.麦芽糖、葡萄糖、山梨醇、蔗糖和乳糖是酵母菌QN-3利用较好的碳源，可溶性淀粉和柠檬酸是利用较差的碳源.硫酸铵与硝酸钾是QN-3能利用的氮源，QN-3生长可不利用维生素，不能利用尿素，不产淀粉类似物，最高耐葡萄糖质量分数为40%，有一定的耐盐性，最高可在盐质量浓度0.015 g/mL的培养基中生长.

表1 QN-3的生理生化特征

2.4 耐镉酵母菌QN-3的生长曲线

镉是酵母菌生长的非必需元素，没有报道对酵母菌生长有利；镉离子进入酵母细胞以后，可以与细胞中蛋白质的巯基相结合，导致与呼吸和其他生理生化活动有关的一些关键酶失去活性，由此来阻碍细胞的正常生理活性，最终抑制菌株的生长[21].为了探索耐镉酵母菌QN-3对于镉的耐受性，研究了不含镉、100 mg/L和500 mg/L含镉液体培养基中培养的生长情况，结果见图3.

由图3可知，在镉质量浓度500 mg/L的液体培养基中，由于镉质量浓度的升高，QN-3进入对数期比在镉质量浓度100 mg/L的培养基中延迟约8 h，菌株QN-3在不含镉和含100 mg/L镉培养基中培养10 h后进入生长对数期，并分别于70 h、84 h后进入稳定期；在含500 mg/L镉培养基中培养18 h后进入生长对数期，72 h后进入稳定期，综合考虑，菌株的培养时间在72 h左右时最好.从同一时间的吸光值来看，菌株QN-3生物量随镉质量浓度增加而有所降低.这可能是因为菌株QN-3对镉有一定的耐受性，在前期生长过程中低质量浓度镉培养基中生长更好，最终相差不大，说明该菌株的耐镉性能较好.

图3 QN-3在不同质量浓度镉培养基中的生长曲线

2.5 耐镉酵母菌QN-3培养条件优化

2.5.1 NaCl质量浓度对QN-3生长的影响

钠离子是微生物发酵培养基的基本成分，有维持细胞的渗透压的作用，所以在培养基中经常会加入一些钠盐给菌种细胞提供一个适宜的生存环境.耐镉酵母菌QN-3在不同 NaCl质量浓度下培养的生长情况见图4.

图4 NaCl质量浓度对QN-3生长的影响

由图4可知：QN-3在镉质量浓度100 mg/L液体培养基中NaCl质量浓度为0时生长最好，随 NaCl质量浓度增高，吸光值不断下降，但是菌株整体依旧处于生长良好状态；QN-3在镉质量浓度500 mg/L液体培养基中NaCl质量浓度为0.01 g/mL时生长最好，无NaCl时的生长情况好于NaCl质量浓度大于0.01 g/mL时的，说明NaCl的加入有利于菌株更好的适应镉环境.随 NaCl质量浓度增高，吸光值不断下降，同样生长良好，可能是因为钠离子的加入，占据了部分金属结合位点，从而导致镉离子的有效结合位点减少，有利于菌株生长.由实验可得，NaCl质量浓度对菌株生长影响不大，菌株同时具有一定的耐盐性，最终确定吸光值都很大的NaCl质量浓度为0.01 g/mL为后续实验使用.

2.5.2 温度对QN-3生长的影响

在酵母菌的生长过程中，酵母菌中酶的活性以及物质的溶解性等都与温度有关，温度的变化会导致菌株的生长速率变化.耐镉酵母菌QN-3在不同温度下培养的生长情况见图5.

由图5可知，QN-3在100 mg/L和500 mg/L质量浓度液体培养基中在20～32 ℃生长比较好，在2种质量浓度中吸光值都很高，几乎没有差别，由实验结果可知，在28 ℃达到了最高值.在20 ℃以下，生长较缓慢，可能是低温影响了细胞中蛋白质的功能与调控方式，导致生长受到抑制；在32 ℃以后，吸光值直线下降，生长受到抑制，可能是温度过高导致细胞停止生长的同时发生死亡并出现破裂，这会影响菌体正常生理代谢，导致吸光度减少.由此可得QN-3是中温菌，在28 ℃条件下培养生长情况最好，可以应用于后续实验中.

图5 温度对QN-3生长的影响

2.5.3 pH对QN-3生长的影响

耐镉酵母菌QN-3在不同pH下培养的生长情况见图6.由图6可知，在100 mg/L培养基中QN-3在pH为3～9时生长较好，在pH为6时生长的最好，从pH大于9时吸光值开始骤降；在500 mg/L培养基中QN-3在pH为3～7时生长较好，在pH为5时生长的最好，从pH大于7时吸光值开始骤降.在高质量浓度的镉环境中，生长pH范围变窄.这可能是由于高镉本身对菌生长有一定的抑制作用，使得菌适应pH的能力变差.结果表明在偏碱性的环境中不利于该菌株生长，中性或偏酸性条件下更适合其生长，并最终确定最适生长的培养基pH为5～6.

图6 pH对QN-3生长的影响

2.5.4 接种量对QN-3生长的影响

生产菌种在发酵过程中生长繁殖的速度由接种量的大小决定，为了缩短发酵时间，可以增大接种量，使产物的形成提前到来.耐镉酵母菌QN-3在不同接种量培养下的生长情况见图7.

由图7可知，菌体QN-3在100 mg/L镉质量浓度培养基中，接种量为6%时生长最好；在500 mg/L镉质量浓度培养基中，接种量为8%时生长最好.从整体来看，接种量对菌体生长影响不大，都生长地很好，为防止后续实验中由于接种量过多导致溶氧量不足，影响产物，故选择中间的接种量6%为后续实验使用.

图7 接种量对QN-3生长的影响

2.5.5 装液量对QN-3生长的影响

菌株培养基中溶解氧的含量与装液量有关，会影响微生物的呼吸作用和某些代谢产物的合成.耐镉酵母菌QN-3在不同装液量下培养的生长情况见图8.

由图8可知，菌体QN-3在镉质量浓度100 mg/L和500 mg/L培养基中都是在装液量为10 mL时生长最好，随着装液量的增加，吸光值在逐渐下降，但是对菌体的生长影响不大.装液量较小，溶氧量高，菌株生长良好，但是发酵空间就浪费了，工业成本也相对增加；装液量过大，溶氧量低，会抑制菌株生长.因此，综合考虑选择了50 mL装液量在后续实验中使用.

2.6 耐镉酵母菌QN-3对镉的吸附特性

2.6.1 QN-3在不同镉质量浓度培养基中的吸附特性

在最佳耐镉生长条件下，测定耐镉酵母菌QN-3在不同镉质量浓度的培养基中的吸附情况，其结果见图9.

由图9可以看出，菌体在镉质量浓度50、100、300、500、800、1 000、2 000、4 000 mg/L的培养基中的吸附率分别为49.42%、36.16%、31.31%、23.01%、19.45%、10.29%、8.39%、5.91%.菌体QN-3在50 mg/L中吸附率最高，在4 000 mg/L中吸附率最低，随着镉质量浓度的升高，吸附率逐渐降低.这可能是由于一定数量的菌体细胞结合重金属位点的数量是有限的，当镉质量浓度升高时，结合位点趋近于饱和状态，不能再吸附更多的镉离子，出现吸附率下降的现象.

图9 不同镉质量浓度的培养基对QN-3吸附率影响

2.6.2 透射电镜(TEM)分析

耐镉酵母菌QN-3培养好后，分别转接到镉质量浓度为0 mg/L和1 500 mg/L的PDA培养基中，28 ℃、120 r/min下培养72 h.其透射电镜结果见图10.

图10 镉处理QN-3菌体前后透射电镜图

图10中a为健康生长的细胞，其形状规则，细胞壁、细胞膜与细胞质贴合正常.菌体内部的物质分布均匀，没有聚集的现象.图b、图c可以明显看出在高镉条件下，酵母菌QN-3的形状发生明显变化.有明显的颗粒附着在细胞表面，菌体形状整体上出现不同程度的凹陷.可以看到细胞内部细胞质分布不均匀，出现多个小聚集的部分，同时出现明显的空泡.其次，酵母菌QN-3在高镉环境下的生长也受到了抑制，明显比无镉环境下的生长缓慢.从微生物角度看，酵母吸附金属镉可以由任何一种或不同过程的组合发生，如络合、配位、螯合、离子交换，真菌生物量可以通过金属吸附到生物的细胞壁、细胞内固存，金属积累和沉淀而成为金属聚集物聚集在细胞周围.可以推测菌体表面的小颗粒为被吸附的Cd2+积聚形成的聚集物.同时有部分金属镉进入细胞内部，直接或间接参与了细胞内部的生长代谢活动，对酵母菌QN-3产生了毒副作用，体现在细胞质出现聚集，细胞内部出现气泡，酵母细胞的生长周期变长.Cd2+对酵母细胞存在毒副作用，使细胞内部发生聚集，产生空泡，细胞外部出现不同程度变形.大多数的Cd2+聚集在细胞表面，少数进入细胞内部，直接或者间接参与代谢过程.高Cd2+质量浓度引起的氧化损伤和膜通透性改变可能是导致细胞形态改变的原因[22]，推测活体酵母菌QN-3对金属镉的吸附机制是胞外吸附为主，少量胞内吸附.

3 结语

本课题筛选出的高耐镉酵母菌株QN-3固体最高耐镉为22 000 mg/L，对镉的耐受性较好.QN-3菌落光滑，呈橘粉色，细胞为椭圆近圆形，具有一定的耐盐性，呈典型的酵母菌形态特征.马克思克鲁维酵母YS-K1在镉质量浓度140 mg/L的培养基中也能生长.与文献报道相比，QN-3在对镉的耐受方面具有明显优势.

经过培养条件优化，耐镉酵母菌QN-3最佳培养条件为NaCl 0.01 g/mL、pH 6.0、温度28 ℃、接种量6%，装液量50 mL.该菌株对镉有良好的吸附性，在低质量浓度中吸附性高于高质量浓度，在镉质量浓度为50 mg/L时，吸附率最高，在培养基中达到49.42%.通过透射电镜分析，酵母菌QN-3吸附过程主要是表面吸附，很少的一部分是吸附在细胞内部.这些被吸附在内部的金属镉对酵母菌的正常生理活动产生了明显的负面作用，主要表现为酵母菌的生长周期延长，细胞形态发生变形，细胞内部出现空泡和细胞器堆积.目前，国内外有很多学者都致力于酵母吸附重金属镉的研究，但大多都集中在酿酒酵母和粘红酵母上，对于其他种属的酵母菌株在该领域的研究极为少见.有些种属酵母菌对镉的吸附性好但耐受性较弱，有些种属酵母菌耐受性虽强但吸附性又较低.酵母菌株QN-3 对于镉具有较强的耐受性，同时，又具有较高的吸附性能，可作为食品、环境、水体中重金属镉修复的良好材料.