潘蓉蓉，钟秋蔚，张 露，马际凯，程强强，袁生贵，孙荣喜

(江西省森林培育重点实验室；江西特色林木资源培育与利用2011协同创新中心；江西农业大学·林学院，江西 南昌 330045)

毛红椿(Toona ciliata var.pubescens)是楝科(Meliaceae)香椿属(Toona)落叶高大乔木，主干通直圆满，材性优良，是我国珍贵速生用材树种，为国家二级保护植物。由于毛红椿天然更新缓慢，人为干扰严重，导致毛红椿分布区不断缩小，呈间断分布，目前极难见到成片分布的林分[1]。前人对毛红椿苗期性状[2]、人工造林[3]、家系选择[4]、药用价值[5]等开展过大量研究，在遗传机理方面研究相对较少。毛红椿现有种群多以无性繁殖为主，遗传多样性较低，现已开发的SSR引物难以揭示小种群内可能存在的遗传学风险[6-7]，且已知毛红椿基因组序列信息有限，开发SSR引物存在一定困难。

目前一些多态性低或特定品种的遗传研究，比如连锁图谱的构建[8]，近缘物种的划分[9]，山白树(Sinowilsonia fienryi)[10]、羽叶丁香(Syringa pinnatifolia)[11]、青檀(Pteroceltis tatarinowii)[12]、凤凰单丛古茶树(Camellia sinensis)[13]和珙桐(Davidia involucrata)[14]等珍稀濒危植物均以AFLP(amplified fragment length polymorphism)开展亲缘关系和遗传多样性研究，并且利用AFLP对非模式生物基因组捕获，创建一种通用的系统发育分析方法[15]。该研究拟对毛红椿AFLP所需模板的制备、产物稀释倍数及引物的筛选进行探索，优化毛红椿AFLP体系，筛选出多态性引物，为该物种保护和遗传多样性研究提供支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料选自江西九连山国家级自然保护区(24°36′N，114°30′E)天然林内的毛红椿植株，共采集41株健康树的幼嫩叶片，硅胶干燥带回实验室提取DNA。其中37株毛红椿的叶片来自润洞毛红椿居群(R1-R37)，其他4株分别采自二级站毛红椿居群(R110)、横坑水毛红椿居群(H14)、虾公塘毛红椿居群(R319)和大丘田毛红椿居群(D62)。

引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。EcoR I、Mse I内切酶购于NEB公司，T4连接酶购于生工生物工程(上海)股份有限公司，Taq酶购于南京诺唯赞生物股份有限公司，DNA提取试剂盒DP305购于天根生化科技(北京)公司。

表1 AFLP所用接头和引物Tab.1 Adapters and primers of AFLP

1.2 试验方法

1.2.1 毛红椿基因组DNA提取和检测

采用改良的CTAB[16]法和试剂盒法提取DNA，探索不同提取方法对DNA质量的影响。用紫外分光光度计和1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度和纯度，将检测质量合格的DNA统一稀释成50 ng·μL-1，-20℃保存。

1.2.2 AFLP反应体系

（1）酶切与连接

酶切与连接采用一步法和两步法。一步法参照李雪萍[17]方法，将酶切与连接液混合，加入样品DNA后，放到37℃恒温培养箱中培养5 h，充分酶切与连接。反应总体积20 μL，含样品DNA 3 μl(50 ng·μL-1)，10×T4 Buffer 2 μL，EcoR I(5 pmol·μL-1)/Mse I(50 pmol·μL-1)接头各1 μL，EcoR I(20 U·μL-1)0.15 μL，Mse I(10 U·μL-1)0.3 μL，T4 DNA Ligase(4 U·μL-1)0.3 μL，加dd H2O补足总体积至20 μL。

两步法参照刘晓莹[18]方法，将DNA在37℃培养箱中酶切3 h，酶切结束后65℃灭活20 min，随后进行连接(酶切与连接间隔时间不宜太久)，取10 μL的酶切原液与接头和T4连接酶在16℃金属浴中连接12 h，结束后65℃灭活20 min，-20℃保存备用。反应总体积及各类试剂量参照一步法。

（2）预扩增

探索酶切与连接产物稀释倍数对预扩增的影响。设置不同稀释倍数分别为2、3、5、8和10倍。反应总体积20 μL，其中稀释后酶切与连接产物取3 μL，10×PCR Buffer(含Mg2+)2 μL，dNTPs(10 mmol·μL-1)0.8 μL，E-0(10 μmol·L-1)/M-0(10 μmol·L-1)引物各0.6 μL，Taq DNA聚合酶(5 U·μL-1)0.2 μL，用ddH2O补足总体积至20 μL；PCR反应程序：94℃3 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃1 min，30个循环；72℃10 min，4℃保存。

（3）选择性扩增

将预扩增产物分别稀释10倍、20倍、30倍、40倍和50倍作为选择性扩增模板。反应总体积20 μL，其中稀释后预扩增产物5 μL，10×PCR Buffer(含Mg2+)2 μL，dNTPs(10 mmol·μL-1)0.8 μL，Mse I(10 μmol·L-1)/EcoR I(10 μmol·L-1)选择性引物各0.6 μL，Taq DNA聚合酶(5 U·μL-1)0.2 μL，用ddH2O补足总体积至20 μL。PCR扩增采用“touch-down”程序：94℃3 min，94℃30 s，65℃(每个循环下降0.7℃)30 s，72℃1 min，13个循环；94℃30 s，56℃30 s，72℃1 min，25个循环；72℃5 min，4℃保存。

1.3 AFLP反应体系测定

选用大丘田毛红椿单株(D62)DNA作为模板，引物为E2/M2(E-ACC/M-CAG)组合，2%琼脂糖凝胶检测酶切与连接产物、预扩增产物和选择性扩增产物，用量为2 μL产物+2 μL 6倍DNA上样缓冲液。

1.4 引物筛选

选用R110、H14、R319、D62等4个毛红椿DNA样本，对8个EcoR I引物和8个Mse I引物组成的64对引物组合进行初筛，在2%琼脂糖凝胶中筛选出能够扩增出条带的引物；再进行复筛，复筛产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳检测。电泳前将选择扩增产物在PCR仪中95℃变性5 min，迅速放置在96孔低温配液模块中防止复性，取4 μL选择扩增产物在1 mm 40孔内点样，300 V，电泳3 h。参照张峰[19]方法进行银染，拍照记录实验结果。

1.5 引物多样性检测

将筛选出的多样性引物对润洞毛红椿居群37个单株(R1-R37)DNA进行扩增，采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行分离检测，计算100~500 bp之间的电泳谱带，根据条带的有无进行1、0记数，在相同迁移位置上有条带记为1、无条带记为0，形成0/1矩阵图输入计算机，进行引物多态性分析。

2 结果与分析

2.1 提取方法对DNA质量的影响

对不同植物或同一植物不同组织器官，DNA提取方法不同，DNA质量也有很大差别。该研究采用的CTAB法和试剂盒法提取的DNA质量不同，CTAB提取的DNA含有多糖、酚、色素等杂质，对AFLP预扩增和选择性扩增PCR过程有抑制作用，PCR扩增后检测不到DNA条带，而试剂盒(天根DP305)提取的DNA质量较高(图1)，能够满足实验要求。

图1 试剂盒提取毛红椿DNA琼脂糖凝胶电泳检测Fig.1 The agarose gel electrophoresis results of T.ciliata var.pubescens DNA extracted by kit

2.2 毛红椿AFLP体系的建立

通过酶切与连接两种方法比较，结果表明两种方法无明显差异。因两步法操作复杂，耗时较长，因此本实验选择一步法开展。AFLP预扩增选取不含选择碱基的引物，经实验发现随着酶切与连接产物稀释倍数的增加，预扩增产物量呈逐渐减少的状态，当酶切与连接产物稀释倍数为3倍时，扩增产物最清楚。可为后续选择性扩增提供较理想的反应模板。当进行选择性扩增时，经琼脂糖凝胶电泳检测，预扩增产物不同稀释倍数对选择性扩增结果有明显影响，当预扩增产物稀释10倍时，能够扩增出清晰条带，影子带较少。

2.3 引物筛选

用64对引物组合进行初筛，在2%的琼脂糖凝胶中进行检测，获得能够清晰稳定扩增出条带的引物24对，图2为部分初筛选择性扩增引物；随后将24对引物组合在6%聚丙烯酰胺凝胶中电泳进行复筛，筛选出4对多态性引物，扩增出的条带数和多态性较高(图3)。在4个毛红椿单株DNA中扩增出147个位点，其中多态性位点122个，不同引物组合扩增效果不同，E-AAC/M-CAA引物扩增位点最多(51个)，但多态性位点较少，多态位点百分率为78.43%；多态性较高的引物为E-ACG/M-CTT，多态位点百分率为96.15%，4对引物平均多态位点百分率为84.36%，可用于毛红椿AFLP分子标记分析(表2)。

图2 部分引物选择性扩增初筛图Fig.2 Part of preliminary screen diagram of selective amplication primers

图3 多态性引物聚丙烯酰胺凝胶电泳Fig.3 Polyacrylamide gel electrophoresis results of polymorphic primers

表2 AFLP多态性引物Tab.2 Polymorphic primers of AFLP

2.4 AFLP体系的稳定性检测

引物E4/M7对润洞毛红椿居群内37个单株DNA样品(R1-R37)进行扩增(图4)，能够扩增出清晰条带，扩增结果稳定，背景清晰，无弥散现象，扩增条带大多分布在100~500 bp，说明基因组酶切完全，AFLP反应体系适用于毛红椿遗传多样性研究。

图4 引物组合E4/M7对37个样品选择性扩增结果Fig.4 Selective amplification results of E4/M7 primer on 37 samples

3 结论与讨论

该研究通过对模板DNA质量、连接产物稀释倍数、预扩增稀释倍数以及Taq酶反复摸索调整得到较稳定体系，20 μLAFLP体系中，DNA含量为150 ng，3U EcoR I和Mse I双内切酶，1.2U T4 DNA连接酶在37℃恒温培养箱中反应5 h，连接产物稀释3倍进行预扩增，预扩增产物稀释10倍进行选择性扩增，选择性扩增产物采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶检测，可获得清晰的条带；从64对引物组合中共筛选出4对多态性较高的引物组合，平均多态性位点百分率84.36%，可为毛红椿遗传多样性和种质资源研究提供支持。

前人研究AFLP分子标记对模板DNA浓度不敏感[17,20]，但是DNA质量是试验成败的关键。不同提取方法，DNA提取质量不同。改良CTAB法是通过氯仿异戊醇等有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚等杂质，加入乙醇进行沉淀，经离心去除上清液得到DNA[21]。经1%凝胶电泳检测CTAB法提取的DNA溶液含有RNA、多糖、色素或酚等杂质，这可能与有机溶剂抽提次数较少(2次)，杂质没有去除干净有关；另外可能乙醇对DNA沉淀时，随着沉淀时间延长，色素、多糖、酚附着在DNA表面，经离心后，明显看出DNA呈褐色而不是白色沉淀物。DNA提取试剂盒采用离心柱法，利用特异性膜与DNA结合达到分离、回收的目的，操作简单、高效，DNA质量较高，杂质少，但是存在提取DNA含量低，所得样品溶液较少(含量一般在30~100 ng·μL-1之间，所得溶液为80~100 μL)，易降解，需-20℃保存。AFLP分子标记对DNA浓度不敏感且用量少，但对DNA质量要求高，因此试剂盒提取的DNA较适用于后续研究。

AFLP酶切与连接一般采用一步法或两步法，如对珙桐[17]、梅花(Prunus mume)[22]、风信子(Hyacinth orientalis)[23]研究的过程中采用一步法，对榧树(Torreya grandis)[24]、广藿香(Pogostemon cablin)[18]采用两步法，不同的研究对象，采用的操作步骤有所差异，该研究发现毛红椿AFLP酶切与连接一步法和两步法无差别，因此选择一步法作为实验步骤。对PCR扩增所需模板稀释倍数进行研究，尤其对预扩增稀释倍数研究，直接影响着选择性扩增的结果。预扩增作为选择性扩增的模板，不稀释或稀释倍数较小，模板浓度过高，导致选择性扩增产物聚集，聚丙烯酰胺凝胶难以区分。稀释倍数过大，导致扩增条带发虚，不整齐，对数据的记录造成困难，因此摸索出合理的稀释倍数对实验结果至关重要。

AFLP引物中，3′末端选择性核苷酸数目对AFLP扩增谱带有很大影响，理论上，每增加1个选择性碱基，将只扩增限制性片段的1/4，而在两个引物上都有3个选择性碱基的情况下，则获得1/4096的片段，一般情况下，选择性碱基数不超过3个。另外，选择性碱基数目还与基因组大小有关，大于106 bp的基因组可选用3个选择性碱基，105~106bp的基因组可用2个选择性碱基[25]。姜志艳[26]对蒙古黄芪(Astragali membranaceus)AFLP分子标记研究，从36对引物组合(“2+2”“2+3”“3+3”)筛选出5对“2+3”多态性引物。本研究从64对引物组合中筛选获得4对多态性引物，在群体中多态性较高，但是获得的多态性引物较少，因此今后对于毛红椿AFLP引物的筛选中，可以考虑“2+2”“2+3”引物组合，进一步筛选更多的、多态性高的引物组合，用于毛红椿遗传分析。

PCR过程中所用到的Taq酶对实验成败至关重要，实验前期从同一厂家购买的普通Taq酶，所得到的图谱条带模糊，难以辨认，因此需要采用较高质量的Taq酶。这一研究结果与明军[22]、吴昊[24]、李雪萍[17]的研究结果一致，不同厂家的酶甚至不同批次的Taq酶对AFLP指纹式样都会有影响。

AFLP在珍稀濒危植物中广泛应用，能较好地扩增出多态性条带，如对濒危物种海菜花(Ottelia acuminate)[27]和珙桐[14]的遗传多样性分析中，分别使用了6对和7对AFLP引物，扩增得到的多态性性位点百分率都较高，证明AFLP分子标记在遗传多样性、亲缘关系和辅助育种方面具有巨大的研究潜力。该研究从64对引物组合中筛选出4条多态性引物组合，共扩增出147个位点，多态性位点122个，平均多态位点百分率84.36%，可用于后续毛红椿AFLP分子标记遗传多样性分析。AFLP分子标记还可以作为挖掘特异性识别位点的分子标记，如杨丹[28]利用AFLP对红三叶(Trifolium pratense)杂交F1代群体的抗、感白粉病单株进行鉴定，辨别真假杂种，为分子辅助育种提供依据，因此利用AFLP开发特异性标记可作为未来研究发展趋势[29]。