娄永峰，宋晓琛，陈兴彬，何 侃，肖复明★

(1.江西省林业科学院·江西省植物生物技术重点实验室，江西 南昌 330013；2.吉安市青原区白云山林场，江西 吉安 343000)

杉木（Cunninghamia lanceolata）是我国最重要的乡土针叶用材树种之一，主要分布在长江以南各省市。广泛的种植区域和悠久的栽培历史，促使杉木形成了一些优良的变异类型，例如红心杉、罗田垂枝杉等。其中红心杉材质坚硬、色泽独特，深受人们青睐。陈山红心杉是红心杉的典型代表，是江西地方特色杉木优良种源，原产于江西省安福县陈山林区，因其心材红褐色且心材比例大而得名[1]。江西省林业科学院最早开展红心杉的遗传改良工作，收集和保存大量的红心杉种质资源，建立国家良种基地。持续收集保存的种质资源为红心杉遗传改良和创新利用提供了丰富的材料，然而庞大的种质资源数量也给其鉴定和评价带来了困难，这就需要一种便捷有效的种质资源鉴定和评价方法[2-3]。20世纪80年代末，DNA分子标记的兴起和发展为种质资源快速有效的鉴定评价奠定了基础[4]。目前DNA分子标记已被广泛应用于林木种质资源鉴定、DNA指纹图谱绘制、分子身份证构建等研究，其中SSR标记由于具有共显性遗传、多态性丰富、重复性高等优点，已成功应用于杨树（Populus L.）、薄壳山核桃（Carya illinoensis）、白蜡（Fraxinus sp.）、茶 树（Camellia sinensis）、板 栗（Castanea mollissima）等[5-10]。

本研究选择已开发的19个SSR标记，利用荧光标记对51个陈山红心杉种子园无性系进行毛细管电泳检测，开展陈山红心杉的遗传多样性分析和分子身份证构建，以期为今后杉木种质资源的鉴定、评价和利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

试验材料来自江西省吉安市青原区白云山林场陈山红心杉1代种子园，共计51个无性系，依次编号C01~C51。2021年5月采集健康的新叶，冰袋保存带回实验室，于－80℃超低温冰箱保存备用。

1.2 基因组DNA提取

利用本实验室改良的CTAB法提取试验材料的DNA，在完成其质量及浓度检测后，定量至约20.0~50 ng·μL-1，并于-20℃保存备用。

1.3 SSR-PCR分析

通过文献检索，从前期已发表的杉木SSR标记中挑选40对标记[11-12]，然后进行初筛。最终确定19个SSR标记用于后续分析。引物均由北京睿博兴科生物技术有限公司合成，且正向引物5′端用荧光基团修饰。

SSR-PCR扩增体系（20.0μL）：DNA模板2.0 μL，正向引物和反向引物各0.5 μL，2×Taq plus PCR Master Mix 10.0 μL，ddH2O 7.0 μL。PCR扩增在ABI-2720上进行。扩增程序为：95℃5 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，35个循环；72℃7 min。PCR扩增产物送北京睿博兴科生物技术有限公司进行毛细管电泳检测分析。

1.4 数据分析

利用Gene Marker 2.2.0分析毛细管电泳检测结果，得到基因型数据。利用Popgene 32软件分析各SSR位点的等位基因（Na）、有效等位基因（Ne）、期望杂合度（He）和观测杂合度（Ho），多态性信息含量（PIC）等。利用Ntsys-pc 2.20v软件计算各无性系之间的遗传相似性系数，并进行UPGMA聚类分析。根据所选SSR引物扩增带型结果绘制分子身份证。

2 结果与分析

2.1 SSR标记多态性分析

利用19个SSR标记对陈山红心杉种子园遗传多样性进行分析（表1、图1）。由表1可知：19个SSR标记共检测到72个等位基因位点，其中多态位点72个，多态性位点百分率为100%。各标记检测到的等位基因数2~11，平均3.8；其中有效等位基因数1.04~3.12，平均1.88；各标记的观测杂合度0.039~0.745，平均0.416，期望杂合度0.039~0.687，平均0.413，其中有7个标记的观测杂合度低于期望杂合度，表现出纯合子过剩，杂合子不足。多态性信息含量（PIC）的变化范围为0.038~0.657，平均0.363，在0.5≥PIC≥0.25之间，为中度多态性，且19个SSR标记中低度和中度多态性位点居多，分别为5个和11个。

表1 陈山红心杉种子园无性系19个SSR标记的扩增结果Tab.1 Amplification results of 19 SSR markers for clones of Red-heart Chinese fir seed orchard

图1 标记H007在陈山红心杉种子园无性系部分样本中的扩增结果Fig.1 Amplification results for some clones of Red-heart Chinese fir seed orchard using H007 makers

2.2 聚类分析

根据19个SSR标记扩增结果，建立矩阵，利用Ntsys-pc软件计算各无性系之间的遗传相似性系数，并进行聚类分析。结果表明：51个陈山红心杉1代种子园无性系之间遗传相似性系数在0.528~1.000之间，平均遗传相似性系数0.728，这表明种子园无性系之间遗传差异较小，亲缘关系较近。

UPGMA聚类结果表明（图2）在遗传相似性系数为0.70时，可将51个无性系可分为6个亚组（Ⅰ~Ⅵ），且各亚组内无性系数量差异明显。其中，Ⅲ亚组内无性系数量最多，包括C07、C18和C22等25个无性系，占49.2%；其次是Ⅰ亚组，包括C01、C29和C41等14个无性系，占27.5%；其余各亚组内无性系数量均较少，Ⅳ亚组和Ⅵ亚组分别为4个无性系（C06、C21、C36和C48为Ⅳ亚组，C12、C19、C25和C45为Ⅵ亚组），Ⅱ亚组3个无性系：C04、C05和C51，而Ⅴ亚组只有1个无性系：C27。

图2 51个陈山红心杉种子园无性系聚类分析Fig.2 Cluster analysis of 51 clones of Red-heart Chinese fir seed orchard

另外，根据聚类分析结果可知：C03、C28和C30，C18和C22，C31和C37，C38和C39，C23和C35，C09和C20，C25和C45这些无性系之间的遗传相似性系数相同，均为1，疑似为同一无性系材料。

2.3 基于SSR标记的分子身份证构建

依据SSR标记的PIC值的高低，依次增加引物数量对种子园无性系进行区分，结合UPGMA聚类结果，最终选择CLSSR09+H097+H076+CLSSR37+H007+CLSSR20+CLSSR38+CLSSR33等8个SSR标记的扩增带型结果构建陈山红心杉种子园无性系的分子身份证。首先根据每个SSR标记扩增带型，由小到大的顺序排列依次编号0~9，若超过9则编号A~Z，生成扩增带型编号（表2），然后将每个SSR标记在各样本中所扩增带型的编号进行串联排列，形成相应的分子身份证编码，同时对每个无性系的分子身份证进行QR编码。如表3所示，8位数字或字母分别代表8个SSR标记在样本中扩增带型，8位数字或字 母 从 左 到 右 依 次 代 表CLSSR09、H097、H076、CLSSR37、H007、CLSSR20、CLSSR38和CLSSR33标记。以C01为例，可知其分子身份证编码是38312431，即表示C1样本在8个标记扩增结果依次为CLSSR09（208/208）、H097（176/179），H076（267/273）、CLSSR037（174/177）、H007（253/259）、CLSSR20（161/161）、CLSSR38（163/172）和CLSSR33（124/163）。

表2 8对SSR标记的扩增带型编号Tab.2 The code of 8 pairs of SSR makers

表3 51个陈山红心杉种子园无性系的SSR分子身份证Tab.3 Molecular identity code of 51 clones of Red-heart Chinese fir seed orchard

在供试的51个陈山红心杉种子园无性系中，得到了43个不同的分子身份证编码，其中，C03、C28和C30三者共享同一分子身份证编码，而C18、C31、C38、C23、C09和C25各 自 分 别 与C22、C37、C39、C35、C20和C45共用一个分子身份证编码。可见，分子身份证代码分析结果与聚类分析结果相符，共用同一分子身份证代码的无性系在聚类分析中遗传相似系数相同。

3 结论与讨论

陈山红心杉是江西地方特色杉木优良种源，对其种子园的遗传多样性研究，有利于其种质资源的保存和利用。本研究中，19个SSR标记在51个陈山红心杉无性系中共检测到72个等位基因位点，平均等位基因数为3.8，平均有效等位基因数为1.88，平均观测杂合度和期望杂合度分别为0.416和0.413，多态性信息含量（PIC）为0.038~0.657，平均0.363。这表明陈山红心杉种子园无性系中存在一定程度的杂合子缺失，遗传背景较狭窄，遗传多样性处于中等水平，但具有一定的选育空间。相比方月等[13]对四川洪雅县国有林场国家杉木良种基地杉木2代种子园的结果，陈山红心杉种子园平均等位基因数（3.8vs10.1）、平均有效等位基因（1.88vs4.71）、平均观测杂合度和期望杂合度（0.416vs0.440，0.413vs0.478）、平均多态性信息含量（0.363vs0.459）都略低。这可能是由于本研究的陈山红心杉种子园为地方特色杉木种子园，其建园无性系来源于江西安福县陈山林区的优树选择，建园无性系选择来源单一，选择范围狭小。

本研究聚类分析结果表明51个陈山红心杉种子园无性系之间的遗传相似度较高（0.528~1.000），部分无性系具有相同的遗传相似系数，这也进一步说明陈山红心杉种子园无性系的遗传多样性处于中等水平，同时可以考虑在今后陈山红心杉种子园营建、新种质创制等过程中适当引入其它红心杉种质资源，增加遗传多样性。

分子身份证是在DNA指纹图谱的基础上，通过不同的编码方式对指纹图谱进行数字化处理后得到字符串形式的结果，更便于种质资源的鉴别与检索[14]。目前SSR标记结合毛细管电泳荧光检测技术已广泛应用于作物、果树、花卉、林木等物种的DNA指纹图谱或分子身份证构建[5,15-18]。对于分子身份证的构建，不同研究采用的编码方法不一样[19]。本研究采用数字与字母相结合的方式，通过将SSR标记扩增的带型按照由小到大的顺序排列并进行编码，得到各无性系的分子身份证代码。本研究选取的8个SSR标记平均多态性信息含量为0.478，具有良好的多态性，其中多态性信息含量高于平均值的有5个，理论上能够区分500多个陈山红心杉无性系种质资源。本研究选取的51份陈山红心杉种质均得到了合理的区分，得到的分子身份证信息可用于今后种质资源的鉴定评价和利用。